羅布麻DEAD-box解旋酶基因（AvDH1）的轉(zhuǎn)錄分析與功能驗(yàn)證.pdf

1、土壤鹽漬化抑制作物生長(zhǎng)，降低農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題，而且土壤鹽漬化的耕地面積正逐年增加。植物的耐鹽性又是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，涉及諸多基因和多種耐鹽機(jī)制的協(xié)調(diào)作用，具體作用機(jī)制仍未闡明。因此，研究植物耐鹽相關(guān)基因的功能具有重要意義，不僅有利于植物耐鹽分子機(jī)制具體作用途徑的明確；而且有利于基因工程有效地提高轉(zhuǎn)基因作物的耐鹽性。本研究對(duì)羅布麻DEAD-box解旋酶的基因(AvDH1)的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，對(duì)AvDH1轉(zhuǎn)

2、化棉花新品系魯613獲得的轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行了耐鹽性鑒定，獲得主要結(jié)果如下： 1.非生物脅迫下羅布麻中AvDH1基因的表達(dá)：Northern雜交分析表明，AvDH1基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而且其mRNA的含量隨著鹽濃度的增加而增加；在鹽脅迫下該基因在羅布麻的根、莖及葉片各組織中組成型表達(dá)；這些說明在鹽脅迫下AvDH1基因?qū)τ诰S持細(xì)胞基本功能可能具有重要作用。在羅布麻的根、莖及葉片各組織中該基因也受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但是其表達(dá)量隨著時(shí)間的

3、延長(zhǎng)逐漸降低，而在滲透脅迫處理下AvDH1基因不表達(dá)，這說明AvDH1基因?yàn)辂}誘導(dǎo)特異表達(dá)基因。在外施脫落酸的處理下該基因也不表達(dá)，這說明該基因受到不依賴于脫落酸的鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。 2.利用花粉管通道技術(shù)將AvDH1基因?qū)媵?13棉花中，獲得的種子在含鹽量為0.5％的鹽池進(jìn)行篩選，獲得4個(gè)耐鹽單株，對(duì)耐鹽單株自交形成的株系進(jìn)行卡那霉素田間篩選，株系T40252全為陽性表現(xiàn)，這說明其基因型為純合型，株系T42047和T

4、40224卡那霉素抗性植株與非抗性植株的比例接近3:1，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)誤差法檢驗(yàn)，這兩個(gè)株系的觀察值和理論值之間相符，符合孟德爾一對(duì)顯性遺傳性狀的分離規(guī)律，這說明其基因型為雜合型；而T41705全為陰性表現(xiàn)，這說明其可能為假陽性植株。對(duì)選至分離株系的抗性植株進(jìn)行自交，通過T3抗感單株的分離比例分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了雜合型符合3:1的孟德爾一對(duì)顯性遺傳性狀的分離規(guī)律。 從3個(gè)株系中隨機(jī)選擇的抗性植株進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增檢測(cè)，抗性單株均擴(kuò)增出大約

5、225bp的目的片段，這與陽性質(zhì)粒擴(kuò)增片段大小相同，而受體魯613對(duì)照無此片斷。進(jìn)行PCR-Southern雜交分析，轉(zhuǎn)基因株系檢出片斷與陽性質(zhì)粒檢出片斷相同，而受體魯613對(duì)照無片斷檢出，此結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，分子雜交結(jié)果表明AvDH1基因已經(jīng)整合入受體棉花魯613的基因組中，并且穩(wěn)定的遺傳。 3.選擇T2代株系中分子雜交表現(xiàn)為陽性的單株和受體魯613的單株，在鹽脅迫條件下，進(jìn)行花粉萌發(fā)鑒定，結(jié)果表明在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系

6、的花粉萌發(fā)率高于受體，差異達(dá)到極顯著水平；對(duì)轉(zhuǎn)基因單株和受體倒四葉，進(jìn)行葉片耐鹽鑒定，結(jié)果表明，在150mmol/L的NaCl濃度下，受體魯613的葉片變黃，葉綠素含量下降了24.3％，而T42047、T40252和T40224的表現(xiàn)趨于一致，僅下降了約5％，顯著高于對(duì)照：其中轉(zhuǎn)基因株系T40252在300mmol/L的NaCl濃度下，葉片才開始變黃，這表明轉(zhuǎn)基因棉花葉片的耐鹽性高于對(duì)照。 4。選擇T3代穩(wěn)定純合的株系，進(jìn)行盆栽

7、耐鹽性鑒定，結(jié)果表明在在300mmol/L的NaCl濃度下，轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)雖然受到一定程度的影響，但是，仍然保持存活，而受體魯613種子不能萌發(fā)或者生長(zhǎng)過程中萎蔫死亡；在100mmol/L與200mmol/L各轉(zhuǎn)基因株系株高與存活率均顯著高于對(duì)照。對(duì)鹽脅迫轉(zhuǎn)基因株系受體魯613的SOD酶活性變化分析表明，在100mmol/L的NaCl濃度下，各株系SOD酶的比活與對(duì)照表現(xiàn)趨于一致，均有大幅上升。在200mmol/L的NaCl濃度下，魯

8、613子葉SOD酶的活性僅略有上升，而T42047、T40252和T40224子葉SOD酶的活性表現(xiàn)趨于一致，增長(zhǎng)了約30％，明顯高于對(duì)照；在100、200mmol/L的NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系T42047、T40252和T40224的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著低于受體魯613。以上結(jié)果表明三個(gè)轉(zhuǎn)AvDH1基因棉花純合株系的耐鹽性顯著提高。 5.核酸序列的預(yù)測(cè)分析表明：AvDH1基因所編碼的氨基酸序列與擬南芥中一個(gè)DEAD-box解旋酶