羅布麻DEAD-box解旋酶基因(AvDH1)的轉(zhuǎn)錄分析與功能驗(yàn)證.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、土壤鹽漬化抑制作物生長,降低農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量,是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題,而且土壤鹽漬化的耕地面積正逐年增加。植物的耐鹽性又是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀,涉及諸多基因和多種耐鹽機(jī)制的協(xié)調(diào)作用,具體作用機(jī)制仍未闡明。因此,研究植物耐鹽相關(guān)基因的功能具有重要意義,不僅有利于植物耐鹽分子機(jī)制具體作用途徑的明確;而且有利于基因工程有效地提高轉(zhuǎn)基因作物的耐鹽性。本研究對羅布麻DEAD-box解旋酶的基因(AvDH1)的表達(dá)特性進(jìn)行了分析,對AvDH1轉(zhuǎn)

2、化棉花新品系魯613獲得的轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行了耐鹽性鑒定,獲得主要結(jié)果如下: 1.非生物脅迫下羅布麻中AvDH1基因的表達(dá):Northern雜交分析表明,AvDH1基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá),而且其mRNA的含量隨著鹽濃度的增加而增加;在鹽脅迫下該基因在羅布麻的根、莖及葉片各組織中組成型表達(dá);這些說明在鹽脅迫下AvDH1基因?qū)τ诰S持細(xì)胞基本功能可能具有重要作用。在羅布麻的根、莖及葉片各組織中該基因也受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá),但是其表達(dá)量隨著時間的

3、延長逐漸降低,而在滲透脅迫處理下AvDH1基因不表達(dá),這說明AvDH1基因?yàn)辂}誘導(dǎo)特異表達(dá)基因。在外施脫落酸的處理下該基因也不表達(dá),這說明該基因受到不依賴于脫落酸的鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。 2.利用花粉管通道技術(shù)將AvDH1基因?qū)媵?13棉花中,獲得的種子在含鹽量為0.5%的鹽池進(jìn)行篩選,獲得4個耐鹽單株,對耐鹽單株自交形成的株系進(jìn)行卡那霉素田間篩選,株系T40252全為陽性表現(xiàn),這說明其基因型為純合型,株系T42047和T

4、40224卡那霉素抗性植株與非抗性植株的比例接近3:1,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)誤差法檢驗(yàn),這兩個株系的觀察值和理論值之間相符,符合孟德爾一對顯性遺傳性狀的分離規(guī)律,這說明其基因型為雜合型;而T41705全為陰性表現(xiàn),這說明其可能為假陽性植株。對選至分離株系的抗性植株進(jìn)行自交,通過T3抗感單株的分離比例分析,進(jìn)一步驗(yàn)證了雜合型符合3:1的孟德爾一對顯性遺傳性狀的分離規(guī)律。 從3個株系中隨機(jī)選擇的抗性植株進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增檢測,抗性單株均擴(kuò)增出大約

5、225bp的目的片段,這與陽性質(zhì)粒擴(kuò)增片段大小相同,而受體魯613對照無此片斷。進(jìn)行PCR-Southern雜交分析,轉(zhuǎn)基因株系檢出片斷與陽性質(zhì)粒檢出片斷相同,而受體魯613對照無片斷檢出,此結(jié)果與PCR檢測結(jié)果一致,分子雜交結(jié)果表明AvDH1基因已經(jīng)整合入受體棉花魯613的基因組中,并且穩(wěn)定的遺傳。 3.選擇T2代株系中分子雜交表現(xiàn)為陽性的單株和受體魯613的單株,在鹽脅迫條件下,進(jìn)行花粉萌發(fā)鑒定,結(jié)果表明在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系

6、的花粉萌發(fā)率高于受體,差異達(dá)到極顯著水平;對轉(zhuǎn)基因單株和受體倒四葉,進(jìn)行葉片耐鹽鑒定,結(jié)果表明,在150mmol/L的NaCl濃度下,受體魯613的葉片變黃,葉綠素含量下降了24.3%,而T42047、T40252和T40224的表現(xiàn)趨于一致,僅下降了約5%,顯著高于對照:其中轉(zhuǎn)基因株系T40252在300mmol/L的NaCl濃度下,葉片才開始變黃,這表明轉(zhuǎn)基因棉花葉片的耐鹽性高于對照。 4。選擇T3代穩(wěn)定純合的株系,進(jìn)行盆栽

7、耐鹽性鑒定,結(jié)果表明在在300mmol/L的NaCl濃度下,轉(zhuǎn)基因株系的生長雖然受到一定程度的影響,但是,仍然保持存活,而受體魯613種子不能萌發(fā)或者生長過程中萎蔫死亡;在100mmol/L與200mmol/L各轉(zhuǎn)基因株系株高與存活率均顯著高于對照。對鹽脅迫轉(zhuǎn)基因株系受體魯613的SOD酶活性變化分析表明,在100mmol/L的NaCl濃度下,各株系SOD酶的比活與對照表現(xiàn)趨于一致,均有大幅上升。在200mmol/L的NaCl濃度下,魯

8、613子葉SOD酶的活性僅略有上升,而T42047、T40252和T40224子葉SOD酶的活性表現(xiàn)趨于一致,增長了約30%,明顯高于對照;在100、200mmol/L的NaCl脅迫下,轉(zhuǎn)基因株系T42047、T40252和T40224的相對電導(dǎo)率均顯著低于受體魯613。以上結(jié)果表明三個轉(zhuǎn)AvDH1基因棉花純合株系的耐鹽性顯著提高。 5.核酸序列的預(yù)測分析表明:AvDH1基因所編碼的氨基酸序列與擬南芥中一個DEAD-box解旋酶

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