轉(zhuǎn)羅布麻DEAD-box解旋酶基因(AvDH1)棉花的耐鹽性鑒定.pdf

1、棉花的耐鹽性較強(qiáng)，是開(kāi)發(fā)鹽堿地的先鋒作物，但是棉花品種間的耐鹽性差異很大，高鹽脅迫嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，利用基因工程提高棉花的耐鹽性具有重要的意義。解旋酶是一類普遍存在于微生物、動(dòng)物和植物中的動(dòng)力蛋白分子。DNA解旋酶能夠打開(kāi)雙鏈DNA并參與DNA的復(fù)制、修復(fù)、重組和轉(zhuǎn)錄，RNA解旋酶能夠催化RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的解旋并參與轉(zhuǎn)錄、核糖體的合成和翻譯起始等過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，解旋酶不僅調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，而且在植物應(yīng)答非生物脅迫過(guò)程中

2、起重要作用。
　　實(shí)驗(yàn)室之前從鹽生植物羅布麻中克隆了一個(gè)鹽誘導(dǎo)表達(dá)的DEAD-box解旋酶基因AvDH1（登錄號(hào)：EU145588），構(gòu)建pBI121表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入陸地棉常規(guī)栽培種魯613中，初步鑒定了一些轉(zhuǎn)基因棉花植株。本研究通過(guò)分子、生理生化和鹽堿地種植等試驗(yàn)，對(duì)轉(zhuǎn)AvDH1基因耐鹽棉花進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定篩選，獲得了耐鹽性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系，同時(shí)對(duì)羅布麻DEAD-box解旋酶AvDH1在棉花中的同源基因進(jìn)行分析，

3、利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系和受體的基因差異表達(dá)，揭示DEAD-box解旋酶提高棉花耐鹽性的分子機(jī)制，獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.利用PCR、Southern和Northern分析，從分子水平上確定羅布麻DEAD-box解旋酶AvDH1已經(jīng)整合入受體棉花基因組并且穩(wěn)定遺傳，選取三個(gè)純合轉(zhuǎn)AvDH1基因株系08-66、08-87、08-26進(jìn)一步分析它們室內(nèi)和田間鑒定的耐鹽性。
　　2.室內(nèi)耐鹽性鑒定表明：正常

4、條件下轉(zhuǎn)AvDH1基因棉花和對(duì)照棉花的生長(zhǎng)狀況和耐鹽相關(guān)的生理指標(biāo)差異不顯著，鹽脅迫處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因棉花種子的發(fā)芽率和植株的株高均顯著高于對(duì)照，其葉片離子滲透和MDA含量均顯著低于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因株系葉片SOD酶活性、脯氨酸含量和K+/Na+離子比均顯著高于對(duì)照，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系之間的差異不顯著。
　　3.2013年和2014年在東營(yíng)鹽生植物園進(jìn)行鹽堿地實(shí)驗(yàn)，在中鹽地塊（ECe9.8 ds m-1）和高鹽地塊（ECe15.6dsm-

5、1）對(duì)轉(zhuǎn)AvDH1基因棉花的農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定。兩年的鹽堿地鑒定結(jié)果表明：在中鹽地塊上轉(zhuǎn)基因株系08-66、08-87和08-26比對(duì)照棉花的籽棉產(chǎn)量分別高15.4％、17.9%和15.9%，而在高鹽地塊上分別高23.9%、26.4%和23.1%，轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)量的增加受益于鈴數(shù)和鈴重的增加。
　　4.為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)羅布麻DEAD-box解旋酶基因（AvDH1）提高棉花的耐鹽性機(jī)制，利用RNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)基因耐鹽棉花和受體魯613

6、棉花進(jìn)行鹽脅迫差異表達(dá)基因分析，結(jié)果表明：鹽脅迫處理后，非轉(zhuǎn)基因株系中共有1359個(gè)基因表達(dá)發(fā)生差異表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中共有1150個(gè)基因表達(dá)發(fā)生差異表達(dá)，其中751個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，399個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。選取部分差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示與RNA測(cè)序差異表達(dá)基因趨勢(shì)基本一致。在差異表達(dá)基因中，有35個(gè)基因是耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)差異表達(dá)基因參與的主要代謝途徑進(jìn)行分析，鑒定了差異表達(dá)基因參與耐鹽的主要代謝途徑為：磷脂

7、酰肌醇信號(hào)途徑、過(guò)氧化物酶體途徑、核糖體合成途徑以及RNA降解途徑等。
　　5.利用生物信息學(xué)的方法，從雷蒙德氏棉花中鑒定了161個(gè)RNA解旋酶基因，并將它們分為DEAD-box、DEAH-box、和DExD/H-box三個(gè)亞家族，其中，AvDH1和DExD/H-box亞家族中GrDExD/H4和GrDExD/H30同源（蛋白水平同源性7
　　4%）。共線性分析表明GrDExD/H4和GrDExD/H30存在共線性關(guān)系，表達(dá)