轉P-,GHCP-∷IPT基因棉花的抗早衰及其耐鹽性分析.pdf

1、植物葉片的衰老是普遍發(fā)生的自然現(xiàn)象，它不是葉片細胞的簡單死亡，而是一種動態(tài)的細胞程序性死亡過程，衰老產(chǎn)生的氮素等營養(yǎng)物質被運至幼嫩的葉片、發(fā)育中的種子和儲藏器官中加以利用或儲存。除了內(nèi)在因素的調(diào)控和影響，葉片的衰老也受環(huán)境因素的影響，如干旱，水澇，高或低太陽輻射，極端溫度，臭氧和其他空氣污染物，土壤鹽分過高，還有土壤中礦質營養(yǎng)不足。通過調(diào)控植物體內(nèi)的細胞分裂素水平，可以延緩葉片衰老，并能提高植物的抗生物和非生物逆境脅迫能力。
　　

2、 本實驗中克隆了來源于棉花的半胱氨酸蛋白酶（Ghcysp）啟動子，并將其與編碼細胞分裂素生物合成途徑的限速酶-異戊烯基轉移酶基因（IPT）構建嵌合基因導入早衰型陸地棉品種中棉所10號，獲得的純合轉PGHCP：：IPT基因植株不僅具有延遲葉片衰老的特性，提高了棉花的產(chǎn)量，改善了纖維品質，還具有良好的耐鹽性，從而為抗衰老、耐鹽轉基因棉花研究提供了優(yōu)異的種質材料。實驗獲得的主要結果如下：
　　 1.根據(jù)Ghcysp編碼區(qū)的上游序列，

3、設計專一引物，利用接頭PCR技術，從早衰型陸地棉品種遼棉所9號中分離得到長度為1045bp的棉花半胱氨酸蛋白酶（Ghcysp）啟動子序列（GenBank號為GQ919043）。利用在線植物作用啟動子分析軟件PLACE與PlantCARE，分析確定了Ghcysp啟動子序列中存在著多個細胞分裂素和逆境脅迫調(diào)控的順式元件，這說明Ghcysp啟動子可以由細胞分裂素和逆境誘導調(diào)控。
　　 2.利用花粉管通道技術，將構建的含有PGHCP：：

4、IPT嵌合基因的植物表達載體pBGI導入早衰型陸地棉品種中棉所10號，經(jīng)PCR和Southern blot檢驗分析表明，外源DNA片段已成功地整合到受體中棉所10號基因組中。經(jīng)過卡那霉素篩選、后代與其父母回交、分離鑒定得到了3個純合的單拷貝轉PGHCP：：IPT棉花株系S1，S2，S3。
　　 3.純合轉PGHCP：：IPT基因棉花后代植株與非轉基因植株生長形態(tài)特征一致，生育期相同。通過對展開天數(shù)不同的葉片衰老進程生理生化指標和

5、外源基因表達分析，結果表明：衰老特異性啟動子（Ghcysp啟動子）啟動了IPT基因的表達，純合轉PGHCP：：IPT基因棉花后代植株顯著或極顯著提高了葉片葉綠素含量，細胞分裂素含量水平和清除活性氧的抗氧化酶活性，葉片衰老得到明顯的延遲。純合轉PGHCP：：IPT基因棉花后代植株較非轉基因植株葉片衰老延遲15天左右。
　　 4.轉PGHCP：：IPT基因棉花后代的田間農(nóng)藝性狀調(diào)查結果表明，純合轉PGHCP：：IPT株系S1，S2，

6、S3籽棉產(chǎn)量比相對應的非轉基因植株分別增產(chǎn)25.4％，23.8％和26.1％。轉基因株系的皮棉產(chǎn)量極顯著高于非轉基因株系的產(chǎn)量，與非轉基因植株相比，轉基因材料的棉纖維一致性、纖維強度提高，纖維長度更長。結果表明，純合PGHCP：：IPT植株后代不僅延緩了植株的衰老，并且提高了棉花的產(chǎn)量，改善了纖維品質。
　　 5.棉花苗期（五葉期）經(jīng)200 mM NaCl處理1天，7天，14天，21天后，純合轉PGHCP：：IPT基因棉花后代植