棉鈴蟲胚胎細(xì)胞系的建立及其對重組桿狀病毒AcMNPV--EGFP的敏感性檢測.pdf

1、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)對昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒生物技術(shù)的應(yīng)用以及對醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、及生物學(xué)的各個領(lǐng)域的發(fā)展都起著重要作用。本文以鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)的棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)卵為實(shí)驗(yàn)材料，建立了一個新的棉鈴蟲胚胎細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)主要從棉鈴蟲胚胎細(xì)胞系的建立、培養(yǎng)、生物學(xué)特性以及昆蟲細(xì)胞系利用等方面進(jìn)行了研究。新棉鈴蟲胚胎細(xì)胞系的建立不但為離體條件下進(jìn)行相關(guān)的分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究提供了潛在材料

2、，也為昆蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)等相關(guān)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:
　　1.棉鈴蟲胚胎細(xì)胞系Ha168的建立
　　使用含有10％的TNM-FH培養(yǎng)基對棉鈴蟲胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)，歷時將近兩年的培養(yǎng)，最終建立了一個生物學(xué)特性穩(wěn)定且生長良好且可以穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，命名為Ha168。
　　2.棉鈴蟲胚胎細(xì)胞系Ha168的鑒定
　　(1)細(xì)胞形態(tài)特征:Ha168細(xì)胞系為貼壁生長型細(xì)胞，以圓形，梭形細(xì)胞為主，還有少量的巨型

3、細(xì)胞，其中圓形細(xì)胞約占77％，大小為14.30±2.804μm，n=100;梭形細(xì)胞約占20％,大小為12.04±2.928×47.09±12.674μm，n=100。
　　(2)細(xì)胞系來源的分子鑒定:對比Sf9細(xì)胞、棉鈴蟲卵與Ha168細(xì)胞系的細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)序列，結(jié)果表明:Ha168細(xì)胞與棉鈴蟲卵COI基因序列相似度為100％，與Sf9細(xì)胞的COI基因序列比對相似度僅為91％。
　　DAF(DNA A

4、mplification Fingerprinting)與RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)的擴(kuò)增譜帶中Ha168與棉鈴蟲卵較為相似，與Sf9明顯不同。
　　以上結(jié)果均表明Ha168細(xì)胞系來源于棉鈴蟲組織。
　　(3)細(xì)胞增殖動力學(xué)特性:繪制了Ha168細(xì)胞系的增長曲線，算出Ha168細(xì)胞系25代時的群體倍增時間為56.8h。
　　(4)核型分析:通過對比發(fā)現(xiàn)0.7％KCL低滲

5、溶液對觀察Ha168細(xì)胞系效果最好，在1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲胚胎細(xì)胞的染色體呈點(diǎn)狀聚集于核區(qū)其結(jié)果呈正態(tài)分布，染色體數(shù)目分布區(qū)間為20～210，平均為71條。
　　(5)凍存與復(fù)蘇特性:對在液氮中凍存了6個月的Ha168細(xì)胞系進(jìn)行復(fù)蘇，觀察發(fā)現(xiàn)其可以正常貼壁生長，說明此細(xì)胞系可以在液氮中長期保存。
　　(6)支原體檢測:PCR檢測Ha168細(xì)胞系，結(jié)果為無支原體污染。
　　3.EGFP在Ha168細(xì)胞系

6、中的表達(dá)水平研究
　　(1)Ha168細(xì)胞系對AcMNPV-EGFP的敏感性:用重組病毒AcMNPV-EGFP感染Ha168細(xì)胞系，Sf9細(xì)胞系作為對照，使用有限稀釋法，測定Ha168、Sf9細(xì)胞系對AcMNPV-EGFP的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Median Tissue Culture Infectious Dose，TCID50)，結(jié)果為:Ha168細(xì)胞系的病毒侵染速度比Sf9細(xì)胞系慢，Ha168細(xì)胞系的TCID50為10-2