復蘇促進因子Rpf對淡水浮游細菌可培養(yǎng)性的影響.pdf

1、自然環(huán)境中大量微生物處于VBNC(Viable but Nonculturable)狀態(tài)，實驗室中微生物的可培養(yǎng)性通常不足1％。造成微生物可培養(yǎng)性低的原因很多，其中一個主要的原因是實驗室條件下缺乏細胞間交流的信號因子。過低的可培養(yǎng)性已經(jīng)成為篩選新型天然活性產(chǎn)物的瓶頸。 革蘭氏陰性菌通常采用小分子化合物作為細胞與細胞間交流的信號分子。在培養(yǎng)基中加入QS(Quorum Sensing)信號系統(tǒng)中的酰基高絲氨酸環(huán)內(nèi)酯(N-acyl h

2、omoserine lactones，AHLs)和參與大多數(shù)革蘭氏陰性菌基因調(diào)控的cAMP均能有效提高海水和淡水中浮游細菌的可培養(yǎng)性。但作為生物活性物質重要來源的放線菌屬于革蘭氏陽性菌，而革蘭氏陽性菌通常使用寡肽作為信號分子。復蘇促進因子Rpf(Resuscitation promoting factor)是第一個被發(fā)現(xiàn)的細菌的細胞因子，在皮摩爾濃度下便能促進休眠期的細菌復蘇和生長。Rpf家族蛋白廣泛分布于革蘭氏陽性菌中，高度保守并具有

3、種間活性。 本文通過在大腸桿菌中克隆表達結核分枝桿菌H<,37>Rv rpfC，經(jīng)IPTG誘導，Ni<'2+> Sepharose純化可溶性重組蛋白；同時制備藤黃微球菌在LMM培養(yǎng)基中對數(shù)生長中后期上清(含天然Rpf)。純化后的rRpfC及藤黃微球菌上清均能顯著縮短休眠狀態(tài)的藤黃微球菌低密度接種(100cells/mL)到基本培養(yǎng)基(LMM)中的延滯期。在重慶北碚縉云山黛湖采集水樣，測定樣品非生物因素：溫度15/8℃，pH 7.

4、38，TOC 4.91mg/mL，COD<,Cr>27.5mg/mL。部分水樣2％戊二醛固定，PI染色，熒光顯微鏡535nm激發(fā)波長下觀察計算得出黛湖浮游細菌含量為1.29x10<'6>cells/ml。將樣品做10倍梯度稀釋，MPN法測得添加rRpfC及藤黃微球菌上清后水樣中浮游細菌可培養(yǎng)數(shù)量約占細菌總數(shù)的0.2％，與對照相當。通過改良的試劑盒法抽提宏基因組DNA及MPN法培養(yǎng)后的細菌總DNA，PCR擴增16S rDNA V3-V5區(qū)