細(xì)菌的分離培養(yǎng)及培養(yǎng)性狀的觀察_第1頁
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文檔簡介

1、實驗四實驗四細(xì)菌的分離培養(yǎng)及培養(yǎng)性狀的觀察細(xì)菌的分離培養(yǎng)及培養(yǎng)性狀的觀察在細(xì)菌學(xué)檢驗中,細(xì)菌的分離培養(yǎng)是重要的基本技術(shù)之一。從混雜微生物中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為分離;純培養(yǎng)是指一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細(xì)菌都是由一個細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。分離培養(yǎng)的目的在于從被檢材料中,或者從污染的眾多雜菌中分離出純的病原菌。細(xì)菌分離培養(yǎng)應(yīng)先從被檢材料或病料中分離培養(yǎng)單個菌落,然后釣取可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng),再將純培養(yǎng)物移植培養(yǎng)。目的要求目的要

2、求1學(xué)習(xí)、掌握需氧菌和厭氧菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)和技術(shù)。2了解細(xì)菌的菌落形態(tài)及其在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀。3了解培養(yǎng)性狀對細(xì)菌鑒別的重要意義。4掌握釣菌、純培養(yǎng)及移植技術(shù)。操作步驟操作步驟一需氧性細(xì)菌分離培養(yǎng)法一需氧性細(xì)菌分離培養(yǎng)法1.平板劃線分離法菌種被其他雜菌污染時或混合菌懸液常用平板劃線法進(jìn)行純種分離,此法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線,使混雜的微生物細(xì)胞在平板表面分散,經(jīng)培養(yǎng)得到分散的由單個微生物細(xì)胞繁殖而

3、成的菌落,從而達(dá)到純化目的。但劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好,需充分冷凝待平板稍干后才可使用;為便于劃線,一般培養(yǎng)基不宜太薄,每皿約傾倒20ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻,平板表面光滑。劃線分離主要有連續(xù)劃線法(圖41)和分區(qū)劃線法(圖42)兩種。劃線法示意圖見圖43。(1)連續(xù)劃線法以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點種在平板邊緣一處,取出接種環(huán),燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板,在平板邊緣空白

4、處接觸一下使接種環(huán)冷卻,然后從接種細(xì)菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線,劃線時平板面與接種環(huán)面成30~40度角,以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線,接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基,線條要平行密集,充分利用平板表面積,注意勿使前后兩條線重疊。劃線完畢,關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán),待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適宜的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài),涂片鏡檢為純種后再接種斜面。(2)分區(qū)劃線法(四分區(qū)劃線法)取菌、接種

5、、培養(yǎng)方法與“連續(xù)劃線法”相似。分區(qū)劃線法劃線分離時平板分4個圖41連續(xù)劃線法圖42分區(qū)劃線法圖43劃線分離示意圖燒烙后,用滅菌刀切開,以其切面直接進(jìn)行涂布,此法適用于含菌量較少的病料的分離。8.營養(yǎng)肉湯分離法當(dāng)組織病料中含病原菌少,或有抗菌藥殘留時,用上述瓊脂斜面或平板分離法可能無菌落長出,這時可以無菌操作剪取一小塊病料直接投入肉湯,經(jīng)37℃培養(yǎng),在肉湯中長出細(xì)菌后,再用瓊脂斜面或瓊脂平板分離。二、厭氧性細(xì)菌分離培養(yǎng)法二、厭氧性細(xì)菌分

6、離培養(yǎng)法細(xì)菌接種后,直接放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng),可以使需氧菌與兼性厭氧菌生長繁殖;但對厭氧菌,則需將培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的氧氣除去,或?qū)⒀趸臀镔|(zhì)還原,降低其氧化還原電勢,才能生長繁殖。在有氧的環(huán)境下,培養(yǎng)基的氧化還原電勢較高,不適于厭氧菌的生長。為使培養(yǎng)基降低電勢,降低培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓是十分必要的?,F(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法很多,主要有生物學(xué)法、化學(xué)法和物理學(xué)法,可根據(jù)各實驗室的具體情況而選用。(一)生物學(xué)方法培養(yǎng)基中含有植物組織(馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷

7、物等)或動物組織(新鮮動物組織小片,或加熱的肌肉、心腦等),因組織的呼吸作用,以及組織中可氧化物質(zhì)的氧化而消耗氧氣(肌肉、腦磷脂中不飽和脂肪酸的氧化,碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用),造成厭氧環(huán)境,以利于厭氧性細(xì)菌的生長繁殖。同時,組織中所含的還原性化合物(谷胱甘肽)也可使氧化還原電勢下降。此外,將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在同一環(huán)境中,則環(huán)境中的氧被需氧菌消耗,造成厭氧環(huán)境,也有利于厭氧菌的生長繁殖。1.動物組織及其他物質(zhì)加入法在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入肝臟、

8、腎臟等動物臟器,因其中的半胱氨酸的一SH基極不穩(wěn)定,為強(qiáng)還原劑,所以可利用此培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng),在培養(yǎng)之前將肝片肉湯加熱,以驅(qū)出空氣,冷卻,然后接種培養(yǎng)。2.共棲培養(yǎng)法將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在同一個平皿內(nèi),利用需氧菌的生長繁殖將氧氣消耗后,造成厭氧環(huán)境利于厭氧菌生長。其具體方法是將培養(yǎng)皿的一半接種消耗氧氣能力極強(qiáng)的需氧菌如靈桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌等。另一半接種厭氧菌,接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上,并用石蠟密封,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)

9、2~3d,即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長。(二)化學(xué)方法利用還原能力強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì),將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣消耗,或還原氧化型物質(zhì),降低氧化還原電勢。1.焦性沒食子酸法焦性沒食子酸在堿性溶液內(nèi)能大量地吸收氧而造成厭氧環(huán)境,有利于厭氧菌的生長繁殖。通常100cm3空間用焦性沒食子酸1g及10%氫氧化鈉或氫氧化鉀10m1。具體方法有下列幾種:(1)平板培養(yǎng)法將厭氧菌劃線接種于適宜的瓊脂平板,取一小團(tuán)直徑約2cm的脫脂棉,置于平皿蓋的內(nèi)面中央

10、,其上滴加0.5ml10%氫氧化鈉溶液;在靠近脫脂棉的一側(cè)放置0.5g焦性沒食子酸,暫勿使兩者接觸。立即將已接種的平板覆蓋于平皿蓋上,迅速用融化的石蠟密封平皿四周。封畢,輕輕搖動平皿,使被氫氧化鈉溶液浸濕的脫脂棉與焦性沒食子酸接觸,然后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24~48h后,取出觀察。(2)Buchner氏試管法(圖44)取一大試管,在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數(shù)個或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養(yǎng)管放入大試管中,迅速加入2%NaOH

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