細菌的培養(yǎng)及鑒定

1、細菌培養(yǎng)及鑒定,,標(biāo)本采集原則,1.及時采集微生物標(biāo)本作病原學(xué)檢查2.在抗菌藥物使用前采集標(biāo)本3.采樣時嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作4.標(biāo)本容器須無菌，但不得有消毒劑5.采樣后立即送檢6.送檢標(biāo)本應(yīng)注明來源和檢驗?zāi)康?咳痰方法,病人先漱口，清潔口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液無痰可用3％～5％NaCl 5ml霧吸約5min導(dǎo)痰以清晨第二口痰為佳標(biāo)本采集后放置時間不超過2小時,清潔中段尿液,盡量取早晨

2、第一次尿液囑患者留取標(biāo)本的前一天晚上少飲水 女性病人收集標(biāo)本前用肥皂水沖洗外陰，再以滅菌清水沖洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻轉(zhuǎn)包皮，清洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流,采集中段尿 采集標(biāo)本后立即送檢！,哥倫比亞血平板—營養(yǎng)要求高的細菌巧克力平板—含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍/麥康

3、凱平板—G-桿菌用SS平板—沙門氏菌和志賀氏菌用M-H平板—細菌藥敏用TCBS平板—弧菌科細菌用沙包氏平板—真菌培養(yǎng)用真菌顯色平板—真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基—分枝桿菌用,常用的培養(yǎng)基種類和用途,臨床標(biāo)本培養(yǎng)基選擇,血： 血培養(yǎng)瓶中斷尿：血平板、mac平板腦脊液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板、mac平板膽汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麥康凱、SS、血平板

4、,細菌接種的基本程序,滅菌接種環(huán),沾取標(biāo)本,接種,滅菌接種環(huán),,,,細菌接種法,平板劃線接種法： ★目的：使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。 ★方法：★分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本★連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本,分區(qū)劃線法(3區(qū)),,,第一區(qū)劃線,,滅菌接種環(huán),,第二區(qū)劃線,滅菌接種環(huán),第三區(qū)劃線,滅菌接種環(huán),,,,,,連續(xù)劃線法,,,細菌培養(yǎng)法,一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：★培養(yǎng)溫度：35℃（采用

5、恒溫培養(yǎng)箱）★培養(yǎng)時間：18～24h二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等,細菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象,菌落★定義：指單個細菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細菌集團。★菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性★菌落類型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細菌堆積物。,菌 落,菌落

6、與菌苔,菌落的三個類型：,1.光滑型菌落（Smooth type Colony） ：又稱S型2.粗糙型菌落（Rough type Colony）：又稱R型3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又稱M型,2024/3/15,16,S型菌落,,R型菌落,,M型菌落,革蘭染色,原理：通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或

7、丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)復(fù)紅等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。,革蘭染色步驟,,涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片

8、 干燥 固定,,,固定的目的：,使細菌的細胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固；可改變菌體對染料的通透性；加熱固定可殺死細菌，比較安全。,結(jié)晶紫 1’ 碘液 1’ 95%乙醇 30” 復(fù)紅1’ 沖洗 濾紙干燥 油鏡觀察,,,,沖洗,沖洗,沖洗,革

9、蘭染色程序,初染,媒染,脫色,復(fù)染,,,紫色（G＋）,革蘭氏染色步驟示意圖,革蘭染色,,,甲菌,,,,,,,,,,,乙菌,,,,,初染,結(jié)晶紫,媒染,碘液,脫色,乙醇,復(fù)染,稀釋復(fù)紅,紫色（G＋）,紅色（G-）,革蘭染色步驟示意圖,【結(jié)果】,細菌被染成紫色者，稱為革蘭陽性菌；而細菌染成紅色者，稱為革蘭陰性菌；,陽性菌——紫色（G+b) 陰性菌——紅色（G-b),,,,G+ 球菌,,顯微鏡下的桿菌,G-桿菌,Figure 2 - G

10、ram stain of Gram - E. coli cells,痰標(biāo)本涂片染色低倍鏡下分類,分級 白細胞（個） 上皮細胞（個） A >25 25 25A、B兩種情況的痰適合做培養(yǎng)，C不合格，應(yīng)重新留標(biāo)本,革蘭染色注意事項,標(biāo)本涂片不宜太厚固定不宜過熱

11、脫色不宜過度選用培養(yǎng)18--24小時菌齡的細菌為宜,抗酸染色,原理：分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色,達到染色目的。,抗酸染色步驟,,1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片 干燥

12、固定,,,抗酸染色步驟,2、染色包括初染、脫色、復(fù)染三步。,石炭酸復(fù)紅維持 3-5’ 3%鹽酸酒精30 ’’ ~1’ 美藍復(fù)染1 ’ 沖洗 干燥 油鏡觀察,,,,,,,,,,,沖洗,沖洗,初染,脫色,復(fù)染,抗酸染色結(jié)果,抗酸菌呈紅色，常堆積成團，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細菌呈蘭色。,抗酸桿菌報告,300個視野僅見到1—8條抗酸桿菌

13、填寫條數(shù)1+：鏡檢查見3-9條抗酸桿菌/100高倍鏡視野2+：鏡檢查見1—9條抗酸桿菌/10高倍鏡視野3+：鏡檢查見1-9條抗酸桿菌/高倍鏡視野4+:鏡檢查見>9條抗酸桿菌/高倍鏡視野,抗酸染色注意事項,染色充分脫色時間寧長勿短在涂抹痰標(biāo)本時嚴(yán)禁對載玻片進行加熱,臨床標(biāo)本培養(yǎng)基選擇,生殖道標(biāo)本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗項目接種相應(yīng)的平板及操作： 淋球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板;念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基；支原

14、體培養(yǎng)則按《支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程》操作；作普通培養(yǎng)則接種血平板和巧克力平板,觀察細菌在平板上的生長現(xiàn)象,血平板：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性mac平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度巧克力平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度,2024/3/15,37,革蘭陰性菌 葡萄球菌,,細菌的初步分類,細菌的分離與純化：自血平板挑出待檢菌株的單菌落進行初步的鑒定。如果混有雜菌，應(yīng)該重新轉(zhuǎn)

15、種分純。染色與鏡檢： 首先通過革蘭氏染色確定基本的分類：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-桿菌（4）G+桿菌。此外，如果鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體，可能是真菌。,金黃色葡萄球菌,最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明顯β溶血環(huán)，顏色呈金黃色、灰白色或檸檬色分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇血漿凝固酶和DNA酶陽性,,2024/3/15,41,葡萄球菌,,,,念珠菌顯色培養(yǎng)基,,綠色—白色念珠菌藍色—熱帶

16、念珠菌白色—其他，細菌被抑制紫色—光滑粉色—克柔假絲酵母菌,,,嗜血桿菌的鑒定途徑,只能在營養(yǎng)條件高的巧克力平板上生長，菌落為中等大小、圓形、灰白色、透明革蘭染色：G-小桿菌衛(wèi)星實驗就可以幫助初步鑒定,2024/3/15,48,嗜血桿菌,,奈瑟氏菌屬鑒定,在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圓形、灰藍色的似露滴狀菌落革蘭染色： G-雙球菌，呈腎形或咖啡

17、豆形，凹面相對氧化酶和觸酶都均為陽性,,奈瑟氏菌屬有11個種，臨床就淋病奈 菌和腦膜炎奈瑟菌 最為重要,奈瑟氏菌屬鑒定流程,菌落觀察：灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血 涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆?fàn)?

18、 氧化酶試驗+ 觸酶+ + 麥芽糖

19、 -- 腦膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌,細菌的鑒定與藥敏,衛(wèi)生部重點監(jiān)控的6種MDRO,MASA:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對苯唑西林耐藥或頭孢西丁誘導(dǎo)實驗陽性CRAB：耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對亞胺培南或美羅培南耐藥 VER：耐萬古霉素腸球菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對萬古霉素耐藥,,ESBLs：產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶細菌。包括：大腸埃希

20、菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌等—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對第3代和第4代頭孢菌素和氨曲南耐藥CRE:耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對亞胺培南等碳青霉烯類耐藥MDR/XDROA:多重耐藥/泛耐藥銅綠假單胞菌—判斷標(biāo)準(zhǔn)：對亞胺培南等碳青霉烯類耐藥,臨床常見問題,痰涂片與痰培養(yǎng)結(jié)果不一致？ 培養(yǎng)和涂片選擇的痰液不同；標(biāo)本采集時間過長，部分苛養(yǎng)菌死亡；選擇藥敏結(jié)果敏感的藥物，臨床治療無效？ 體外藥敏

21、試驗只能預(yù)測體內(nèi)治療效果，并不等同；一般來說，耐藥=治療無效，敏感≠治療有效,,今天培養(yǎng)結(jié)果與前天結(jié)果不一樣？1）取材是否規(guī)范？2）痰標(biāo)本有時候選擇優(yōu)勢菌做，可能結(jié)果 不一樣3）抗生素的使用鑒定結(jié)果為四聯(lián)球菌、革蘭陽性桿菌，為何沒有藥敏結(jié)果？1）四聯(lián)球菌為微球菌，一般不引起人體致病，考慮為污染2）革蘭陽性桿菌目前沒有參照標(biāo)準(zhǔn)，故暫不做藥敏試驗，若需要治療參考陽性球菌用藥,,B群鏈球菌——寄生在產(chǎn)婦生殖道。孕產(chǎn)婦膿毒血癥和