辣椒根際拮抗菌篩選、鑒定及多粘類芽孢桿菌SC2拮抗相關(guān)基因克隆.pdf

1、以辣椒根腐病原菌(Fusarium solani)為指示菌，從貴州辣椒根際篩選到5株具有明顯拮抗效果的細(xì)菌，編號(hào)分別為：SC2、SC2-4、SC2-4-1、SC2-4-2和SC2-4X。5個(gè)菌株抗菌譜較廣，對(duì)黃瓜枯萎病原菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum)、黃瓜霜霉病原菌(Pseudoperonosporacubensis)、芹菜灰霉病原菌(Botrytis cinerea Pers)以及西紅柿灰霉

2、病原菌(Botrytis cinerea)也具有良好的拮抗性能。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)和16S rDNA序列分析，將SC2、SC24-2、SC2-4X鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，SC2-4、SC2-4-1鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。SC2菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可能為蛋白類或抗菌肽類物質(zhì)。 β-1，4-木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，P.p

3、olymyxaSC2能同時(shí)產(chǎn)生β-1，4-木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶。以菌株SC2的基因組DNA為模板，通過(guò)熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Thermal asymmetric interlacedPCR，TAIL-PCR)方法克隆到4807bp的DNA片斷。DNAMAN軟件分析，該DNA片斷包含兩個(gè)開放閱讀框(open reading frames，ORF)，ORF1長(zhǎng)度為1908 bp，編碼含635個(gè)氨基酸、分子量為67.8 kDa

4、的蛋白；ORF2長(zhǎng)度為714 bp，編碼含237個(gè)氨基酸、分子量為26.8 kDa的蛋白。BLAST分析結(jié)果表明，ORF1與已報(bào)道的P.polymyxa ATCC 842的xynD基因相似性為94％，ORF2與P.polymyxa WY110的gluB基因相似性為99％?；蛐蛄械南到y(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步說(shuō)明，ORF1和ORF2分別為β-1，4-木聚糖酶基因xynD和β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因gluB。 用已報(bào)道的檢測(cè)非核糖體肽

5、合成酶(non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs)基因保守區(qū)的兼并引物TGD和LGG為引物，以P.polymyxa SC2的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一段長(zhǎng)度為497bp的NRPS基因保守區(qū)序列。采用TAIL-PCR方法，以SC2基因組DNA為模板，根據(jù)獲得的NRPS基因保守區(qū)序列，分別向兩側(cè)翼設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)NRP1、LNRP2、LNRP3和RNRP1、RNRP2、RNRP3，分別與隨

6、機(jī)引物(arbitraryprimers)建立擴(kuò)增體系，擴(kuò)增該已知序列的兩側(cè)序列。隨后多次設(shè)計(jì)TAIL-PCR特異性引物，進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增。同時(shí)，根據(jù)已知的B.subtilis bamC、B.subtilis mycC、B.subtilis ituC和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42 bmyC序列，設(shè)計(jì)兼并引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的所有序列拼接，得到長(zhǎng)度為19040bp的DNA

7、序列。DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)，該DNA序列包含一個(gè)5’-末端不完整的17502bp ORF。BLAST分析結(jié)果表明，該ORF與P. polymyxa E681 fusA的6214-23727bp序列相似性為90％，其推測(cè)的氨基酸序列相似性為92％。對(duì)P. polymyxa SC2的FusA的5333個(gè)氨基酸的多肽片斷進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，該多肽片斷包含四個(gè)模塊，分別為C-A-T、C-A-T-E、C-A-T-E和C-A-T；四個(gè)模塊

8、的A結(jié)構(gòu)域可能識(shí)別的特異性氨基酸底物分別為L(zhǎng)-Tyr、D-Thr、D-Asn和Ala，與fusaricidin C的后四個(gè)氨基酸殘基組成和順序一致。P.polymyxa SC2的FusA片斷的四個(gè)A結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與P.polymyxa E681的FusA的A3、A4、A5和A6結(jié)構(gòu)域的相似性分別為86％、94％、98％和96％；其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列相似性分別為85％、89％、94％和92％。推測(cè)，菌株P(guān). polymyxa SC2 f