炎癥模型在結(jié)腸炎治療藥藥效學(xué)評(píng)價(jià)及何首烏毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用.pdf

1、目的和意義:本論文第一部分旨在建立大鼠急性炎癥性腸病模型，并針對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)間相互調(diào)控，選取了以抗氧化應(yīng)激功能為主的維生素E和潛在抗抑郁治療藥-新型CRFR1受體拮抗劑P16，對(duì)IBD動(dòng)物模型進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，以期為臨床治療IBD提供合理數(shù)據(jù)支持。本研究第二部分旨在建立與臨床特征更為接近的何首烏致大鼠肝損傷動(dòng)物模型，研究何首烏醇提液對(duì)大鼠的急性毒性，以期為臨床合理用藥及監(jiān)測提供試驗(yàn)依據(jù)，探討TLR4與何首烏致肝損傷相關(guān)性并應(yīng)用i

2、TRAQ技術(shù)進(jìn)行模型動(dòng)物肝臟差異表達(dá)蛋白篩選，探究何首烏致肝損傷可能機(jī)制。觀察潛在藥物性肝損傷血清生物標(biāo)志物micro RNA-122在該模型中表達(dá)變化，為篩選潛在診斷生物標(biāo)志物提供可能。
　　材料與方法:1.IBD炎癥動(dòng)物模型的建立及治療藥的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。(1)葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)大鼠急性IBD模型的建立及維生素E治療IBD藥效學(xué)評(píng)價(jià)。將雄性Wistar大鼠分為如下6組，空白對(duì)照

3、組(Ctrl)，DSS組(DSS)，潑尼松龍組(P)，維生素E低劑量組(EL)，維生素E中劑量組(EM)，維生素E高劑量組(EH)。除空白對(duì)照組外，各組均給予5％葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)連續(xù)自由飲用7天，用以建立急性IBD動(dòng)物模型。第8天，Ctrl組及DSS組半數(shù)動(dòng)物麻醉后采血并活檢。以體重、臟器系數(shù)、臨床觀察評(píng)分及組織病理檢查等指標(biāo)判定模型是否建立成功。模型成功建立后，以潑尼松龍為陽性治療對(duì)

4、照藥，并給予低、中、高三個(gè)劑量的維生素E連續(xù)7天對(duì)炎癥動(dòng)物模型進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。第15天，剩余動(dòng)物全部麻醉后采血并活檢，依照體重、臟器系數(shù)、臨床觀察評(píng)分及組織病理檢查等指標(biāo)判定治療效果。其中，建模成功后，及治療結(jié)束時(shí)應(yīng)用Elisa檢測結(jié)腸中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量，用以判定維生素E抑制IBD可能機(jī)制。(2)同樣的研究方法用于研究P16干預(yù)及治療IBD藥效學(xué)評(píng)價(jià)。將雄性Wistar

5、大鼠分為如下9組，空白對(duì)照組(Ctrl)，DSS組(DSS)，潑尼松龍組(P)，P16干預(yù)低劑量組(pre-P16L)，P16干預(yù)中劑量組(pre-P16M)，P16干預(yù)高劑量組(pre-P16H)，P16治療低劑量組(P16L)，P16治療中劑量組(P16M)和P16治療高劑量組(P16H)。除空白對(duì)照組外，各組均給予5％ DSS連續(xù)自由飲用7天，用以建立急性IBD動(dòng)物模型。在建立IBD動(dòng)物模型過程中，同時(shí)連續(xù)7天給予低、中、高三個(gè)劑

6、量P16進(jìn)行干預(yù)給藥。第8天，Ctrl組及DSS組半數(shù)動(dòng)物麻醉后采血并活檢。以體重、臟器系數(shù)、臨床觀察評(píng)分及組織病理檢查等指標(biāo)判定模型是否建立成功。模型成功建立后，以潑尼松龍為陽性治療對(duì)照藥，并連續(xù)7天分別給予P16L、P16M、P16H組低、中、高三個(gè)劑量的P16，各P16干預(yù)組停止給予DSS及不同劑量P16，對(duì)炎癥動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)及治療藥效學(xué)評(píng)價(jià)。第15天，剩余動(dòng)物全部麻醉后采血并活檢，依照體重、臟器系數(shù)、臨床觀察評(píng)分及組織病理檢查

7、等指標(biāo)判定治療效果。其中，建模成功后，及治療結(jié)束時(shí)應(yīng)用Elisa檢測結(jié)腸中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量，用以判定判定P16干預(yù)及治療IBD可能機(jī)制。2.何首烏致肝損傷炎癥動(dòng)物模型的建立，其可能機(jī)制探究及潛在生物標(biāo)志物microRNA-122的驗(yàn)證。(1)預(yù)篩選何首烏致特異質(zhì)肝損傷炎癥動(dòng)物模型激活劑。(2) LPS激活后給予動(dòng)物何首烏醇提液進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，按照改良寇氏法測定何首烏醇

8、提液對(duì)SD大鼠口服半數(shù)致死量(LD50)、最大耐受量(MTD)和最大給藥量(MLD)。
　　結(jié)果:1.IBD炎癥動(dòng)物模型的建立及治療藥的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。(1)與空白對(duì)照組相比，連續(xù)給予大鼠5％DSS自由飲用7天后， DSS組大鼠出現(xiàn)明顯的溏便及血便，臨床觀察評(píng)分顯著升高(p＜0.05)，且胸腺皮質(zhì)、脾臟白髓及腸系膜淋巴結(jié)發(fā)生不同程度萎縮，肝臟、脾臟、結(jié)腸可見明顯的膨大腫脹，淋巴細(xì)胞壞死;病理組織切片可見，結(jié)腸部位明顯潰瘍，并伴有黏膜脫

9、落;結(jié)腸及腸系膜淋巴結(jié)中促炎因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量顯著升高，說明免疫細(xì)胞異常活化，DSS誘導(dǎo)的大鼠急性IBD模型成功建立。模型成功建立后，DSS模型對(duì)照組自行恢復(fù)7天效果不明顯，各給藥組結(jié)腸中IL-12、IL-18、TNF-α顯著降低，且表現(xiàn)出不同程度的治療作用。(2)第15天，干預(yù)及治療給予P16可有效抑制DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠體重減輕癥狀，臨床觀察評(píng)分可見大鼠稀便等現(xiàn)象顯著緩解。剩

10、余大鼠麻醉后活檢可見，大鼠結(jié)腸炎癥得到緩解。與DSS組大鼠結(jié)腸相比，P16三個(gè)干預(yù)組結(jié)腸僅出現(xiàn)輕微粘膜潰瘍。2.何首烏致肝損傷炎癥動(dòng)物模型的建立，其可能機(jī)制探究及潛在生物標(biāo)志物microRNA-122的驗(yàn)證。(1)前期模型篩選，分別用3.5％ DSS與4mg/kg LPS作為激活劑，與DSS組相比，給予SD大鼠20倍臨床劑量何首烏后7天，可見LPS組動(dòng)物全部出現(xiàn)溏便，眼瞼分泌異常，臟器系數(shù)增加顯著，ALT顯著升高，組織病理學(xué)觀察可見枯否

11、細(xì)胞激活，伴有少量肝細(xì)胞變性，且肝損傷率高于DSS組。此外雄性較雌性對(duì)何首烏誘導(dǎo)大鼠肝損傷敏感。(2)因此以LPS為激活劑，給予何首烏可見大鼠出現(xiàn)主要毒性癥狀為腹瀉、眼漬，怠動(dòng)，毛色不滑，隨著藥物劑量的增大，癥狀有所加重。依次根據(jù)給藥劑量大鼠死亡情況為雄性1，0，2，3，5只，雌性1，0，4，4，5只，在給藥后2-3天大鼠較空白對(duì)照組體重有所下降，14天后給藥組大鼠肝臟系數(shù)沒有明顯變化，血液生化檢測發(fā)現(xiàn)，給藥組相對(duì)空白對(duì)照組轉(zhuǎn)氨酶(AL

12、T、ALP)沒有顯著性增加。其MTD為30g/kg、MLD為90g/kg、LD50為53.26g/kg，分別相當(dāng)于臨床擬用劑量的150、450和266.3倍，LD50的95％可信限為46.91～60.46g/kg。(3)經(jīng)單次LPS激活后，隨著何首烏給藥次數(shù)增加，LPS+PMT-L組和LPS+PMT-H組大鼠體重減輕。第8天，病理大體檢查發(fā)現(xiàn)LPS+PMT-L組和LPS+PMT-H組大鼠肝臟輕微腫脹。肝臟組織病理學(xué)觀察可見LPS+PMT

13、-H組顯著肝細(xì)胞變性、局部慢性炎性灶且肝損傷程度較LPS+PMT-L組嚴(yán)重，PMT-L組及PMT-H組僅見極少量肝細(xì)胞變性。APAP組可見肝細(xì)胞壞死。而LPS組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。LPS+PMT-L和LPS+PMT-H組可見顯著肝細(xì)胞變性、局部慢性炎性灶，何首烏給藥濃度與肝損傷程度正相關(guān)。即何首烏致大鼠肝損傷炎癥模型建立成功。(4)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)肝臟mTLR4表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn)，LPS組升高后恢復(fù)正常，而經(jīng)誘導(dǎo)的LPS+PMT-L

14、組和LPS+PMT-H組顯著升高，與肝損傷程度正相關(guān)。應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對(duì)模型動(dòng)物肝臟進(jìn)行差異表達(dá)蛋白篩選，發(fā)現(xiàn)gi|13242301|ref|NP_077367.1|該模型差異表達(dá)蛋白，其對(duì)應(yīng)基因?yàn)閑stradiol17-beta-dehydrogenase2，對(duì)應(yīng)人源蛋白為HSD17B2。(5)第2小時(shí)，與空白對(duì)照組相比，尾靜脈注射LPS2小時(shí)后，LPS組大鼠血清ALT/ALP，microRNA-122表達(dá)量顯著升高(p＜0.05)

15、。第14小時(shí)、第5天、第8天，LPS+PMT-L組和LPS+PMT-H組大鼠血清ALT/ALP改變未超過正常值范圍。LPS組與Ctrl組大鼠血清microRNA-122的表達(dá)未見顯著差異，而在LPS+PMT-L組，LPS+PMT-H組，APAP，LPS+APAP組大鼠血清組microRNA-122顯著性增加(P＜0.05)。此外，與Ctrl組相比，不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)，如microRNA-122、mTLR4相對(duì)均值表達(dá)情況顯示:第8天，與A

16、LT/ALP相比，LPS+PMT-L組和LPS+PMT-H組大鼠血清中micro RNA-122和肝臟中mTLR4表達(dá)顯著上調(diào)，且LPS+PMT-L組和LPS+PMT-H組比PMT-L組和PMT-H組升高顯著。
　　結(jié)論:1.IBD炎癥動(dòng)物模型的建立及治療藥的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。(1)綜合臨床觀察評(píng)分、組織切片觀察、細(xì)胞因子檢測等指標(biāo)進(jìn)行分析，急性IBD動(dòng)物炎癥模型建立成功。(2)維生素E可緩解DSS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎，緩解效果與給藥劑量呈正

17、相關(guān)。其作用機(jī)制可能是通過抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)大鼠結(jié)腸IL-12、IL-18、TNF-α分泌，來緩解DSS誘導(dǎo)的大鼠急性IBD。(3)新型選擇性CRFR1拮抗劑P16對(duì)干預(yù)及治療DSS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎癥狀有效。其可能機(jī)制與調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、TNF-α和IFN-γ密切相關(guān)。且給予P16后，大鼠未見顯著肝損傷。即P16可作為潛在治療IBD的藥物。2.何首烏致肝損傷炎癥動(dòng)物模型的建立

18、，其可能機(jī)制探究及潛在生物標(biāo)志物microRNA-122的驗(yàn)證。(1) LPS激活枯否細(xì)胞可觸發(fā)何首烏特異質(zhì)肝毒性;(2)新型何首烏致大鼠肝損傷模型已經(jīng)成功建立，與目前常用何首烏致肝損傷動(dòng)物模型相比，新模型與臨床更為相近。(3)新型何首烏致大鼠肝損傷的作用機(jī)制與肝臟mTLR4表達(dá)水平有關(guān)，且損傷程度與肝臟mTLR4的表達(dá)呈正相關(guān)。(4)與傳統(tǒng)血清肝臟生物標(biāo)志物ALT/ALP相比，血清microRNA-122變化更靈敏，且表達(dá)穩(wěn)定，可作為