食管內環(huán)外縱平滑肌層的構建及其體內培育.pdf

1、目的：根據天然食道肌層內環(huán)外縱的雙層結構，制備出一種具有雙面微槽構造的生物降解性的聚氨酯(PU)支架，作為食道肌層損傷修復的替代物，引導食道外縱肌和內環(huán)肌的再生，并在動物體內進行肌層的在體培育，為食道疾病的治療提供了基礎的實驗依據。
　　方法：通過組織塊貼壁的方法，從新西蘭大白兔食道中提取并培養(yǎng)原代平滑肌細胞(SMCs)，作為實驗用種子細胞。同時，課題組自制了帶有兩種微槽構造的硅材質模具，微槽構造分別為：具有連續(xù)凹槽的圖案(P1)

2、，槽寬200 um，槽深30 um，槽間距30 um；和具有不連續(xù)凹槽圖案(P2)，槽寬100 um，槽深30 um，間隔30 um，間隔前后間距30 um，間隔長150 um，以無圖案的PU支架(P3)作為對照。將醫(yī)用的生物可降解的PU材料溶于1,4-二氧六環(huán)溶液中，得到PU溶液，倒在用上述自制模具制備的子模具(PDMS)上，制備了兩種上述 P1和P2圖案的支架 PU1和PU2。通過對制備的PU支架進行絲素蛋白(SF)的接枝得到PU1

3、-SF和PU2-SF，提高其表面的親水性能，進一步提高其生物相容性。將上述原代 SMCs種植于改性前后的支架上，檢測 SMC在其上的生長特性，利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測細胞在支架上生長率，利用細胞免疫熒光實驗和掃描電鏡(SEM)檢測支架表面細胞的生長形態(tài)及鑒定細胞類型，利用蛋白印跡實驗檢測支架上平滑肌細胞的表達肌動蛋白的能力，通過上述幾種方法來探索制備的PU支架對 SMCs具有良好的細胞相容性和細胞生長的方向性誘導作用，細胞在 P

4、U2-SF上的生長率優(yōu)于PU1-SF，并且更能保持平滑肌的形態(tài)。為了在實驗動物體內誘導再生組織中血管的生長，根據前期實驗結果采用對上述改性后支架接枝血管內皮生長因子(VEGF)的方法。另外，為緩解支架成管后內面的機械張力，將點斷的PU2作為管子內層，而連續(xù) PU1作為管子外層，用1,4-二氧六環(huán)將二層支架以微槽垂直取向黏合成具有雙面微槽的復合支架。建立動物食管肌層缺損模型，將制備的支架植入損傷處，進行體內原位替代實驗，包括片狀支架替代和

5、環(huán)狀支架整環(huán)替代，以觀察并培養(yǎng)食道外縱肌和內環(huán)肌的生長，H&E染色檢測支架對損傷面的修復和再生作用。
　　結果：在體外通過組織塊貼壁法成功獲取了原代平滑肌細胞，傳至多代后仍能保持良好的平滑肌形態(tài)，實驗用到的細胞為2~4代。制備了兩種微槽構造的復合支架，通過對細胞-支架的體外復合培養(yǎng)及檢測，證明絲素蛋白改性后能促進支架上細胞的生長，細胞也能沿著支架紋路的方向取向，這對平滑肌細胞維持其生物功能非常重要。體內原位替代結果顯示，制備的支架