創(chuàng)新脂毒性抗癌藥物德氮吡格藥效學(xué)及作用機(jī)制研究.pdf

1、癌癥是威脅人類生命的主要?dú)⑹种?世界上許多國家癌癥發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢,預(yù)計(jì)到2030年,因癌癥死亡人數(shù)將超過1100萬。在臨床應(yīng)用的200多種化療藥物中,大部分屬于細(xì)胞毒類抗癌藥物,他們在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)影響正常細(xì)胞的生理功能從而帶來一系列嚴(yán)重毒副反應(yīng),加上化療藥物耐藥性等問題成為限制化療藥物應(yīng)用的主要原因。因此尋找高效低毒的新型非細(xì)胞毒性化療藥物成為當(dāng)今抗腫瘤藥物研發(fā)的大趨勢。
　　 本課題研究的德氮吡格(

2、Tetrazanbigen,TNBG)是自主創(chuàng)新設(shè)計(jì)合成的含有“2-苯基萘三環(huán)共平面結(jié)構(gòu)”的氮雜甾烷類化合物,已獲中國發(fā)明專利授權(quán)。在國家自然科學(xué)基金(基金編號(hào):30371612和30772595)資助下,經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):TNBG對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞具有良好的抗腫瘤活性,且與其他常用抗腫瘤藥物無交叉耐藥性;再經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),TNBG能延長荷瘤小鼠和荷瘤兔生存期,并且發(fā)現(xiàn)在TNBG治療的腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)有大量脂質(zhì)聚集;進(jìn)一步經(jīng)基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)和

3、其他相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TNBG一方面可能通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARy)靶點(diǎn)和激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)靶點(diǎn)或通路增加內(nèi)源性甘油三酯、膽固醇等脂質(zhì)合成,另一方面可能抑制微粒體甘油三酸酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTTP)轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì),從而引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集,為此,本課題組提出了TNBG以脂代謝相關(guān)的PPARγ、SREBPs以及MTTP等為靶點(diǎn)的非細(xì)胞毒性抗腫瘤作用的新觀點(diǎn)。為了確證這一觀點(diǎn),本課題組采用尺寸排阻色譜

4、一高效液相色譜法(Sizeexclusion chromatograph HPLC,SEC-HPLC),考察了體外表達(dá)全長人PPARγ重組蛋白受體與配體TNBG的結(jié)合影響,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TNBG與PPARγ結(jié)合的Kd為1000nM,這表明TNBG與PPARγ的結(jié)合是特異性的。
　　 基于此,本文為了進(jìn)一步研究TNBG在細(xì)胞水平與PPARγ靶點(diǎn)結(jié)合的情況,探討TNBG的“脂毒性”抗腫瘤藥效學(xué)及其作用機(jī)制,主要開展的工作和結(jié)論如下:<

5、br>　　 1在抗腫瘤體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中,選用了實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤等六株細(xì)胞為模型細(xì)胞,采用MTT法,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNBG對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用具有濃度依賴性,其半數(shù)抑制濃度(IC50)在2-9μg/ml之間。其中TNBG對(duì)人肝癌細(xì)胞株QGY-7701的IC50值最低,為2.13±0.65μg/ml(n=3)。由此表明TNBG體外抗瘤譜較廣且活性較強(qiáng)。
　　 2在抗腫瘤體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中,構(gòu)建了裸鼠人肝癌細(xì)胞株QGY-7701異種移

6、植瘤模型,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):①用TNBG(劑量1.5mg/kg)連續(xù)治療5周后,對(duì)人肝癌細(xì)胞株QGY-7701裸鼠移植瘤抑瘤率為87.02％;②TNBG治療組裸鼠的體重、免疫功能、肝功能、腎功能和血脂水平與對(duì)照組比較無顯著性差異(P＞0.05);③采用脂質(zhì)特異性蘇丹Ⅲ染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),只有TNBG治療組腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)有大量脂質(zhì)聚集,而對(duì)照組和TNBG治療組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、主動(dòng)脈切片顯示均無脂質(zhì)聚集;④給藥期間,TNBG治療組裸鼠的生

7、命體征平穩(wěn),精神、進(jìn)食、排便等活動(dòng)正常。由此表明TNBG在人肝癌細(xì)胞株QGY-7701裸鼠異種移植瘤模型上能特異性地引起腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)聚集,從而使腫瘤細(xì)胞因“脂毒性”死亡,這就表明TNBG抗腫瘤的“脂毒性”作用具有腫瘤細(xì)胞靶向性,體內(nèi)抗腫瘤活性較強(qiáng)且毒副作用較小。
　　 3采用RNA干擾技術(shù),建立了人肝癌細(xì)胞株QGY-7701的PPARγ表達(dá)抑制的“psiHIVU6-PPARy-QGY”細(xì)胞模型。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(

8、RT-PCR)方法,在mRNA水平上發(fā)現(xiàn)PPARy被抑制了80%;采用Westem blot技術(shù),在蛋白水平上發(fā)現(xiàn)PPARγ被抑制了71%。干擾效果最好的干擾序列為“TCTTCCGGAGAACAATCAG”,并將干擾效果最好的序列轉(zhuǎn)染得到的細(xì)胞命名為“psiHIVU6-PPARy-QGY”細(xì)胞。這就為TNBG抗腫瘤作用機(jī)制研究和基于PPARγ靶點(diǎn)的藥物篩選提供了可靠的細(xì)胞模型。
　　 4在體外腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)聚集實(shí)驗(yàn)中,①采用脂質(zhì)特

9、異性油紅O染色法,從脂質(zhì)定性角度發(fā)現(xiàn)TNBG可以誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株QGY-7701產(chǎn)生大量脂質(zhì)聚集,且隨TNBG處理時(shí)間延長和濃度增加,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集不斷增加,并觀察到腫瘤細(xì)胞生長受到明顯的抑制。②采用MTT方法,考察了TNBG對(duì)“psiHIVU6-PPARy-QGY”細(xì)胞增殖的影響,經(jīng)實(shí)驗(yàn)并計(jì)算得到TNBG對(duì)“psiHIVU6-PPARγ-QGY”細(xì)胞的IC50值為3.21±0.10μg/ml(n=3),而TNBG對(duì)人肝癌細(xì)胞株QGY-

10、7701的IC50值為2.13±0.65μg/ml(n=3),二者有顯著性的差異(P＜0.05),這表明了人肝癌細(xì)胞株QGY-7701中PPARγ表達(dá)抑制減少了TNBG誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集,顯著降低了TNBG引起“脂毒性”導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的作用。③采用全自動(dòng)生化分析方法對(duì)脂質(zhì)成分進(jìn)行定量檢測發(fā)現(xiàn),(1)與人肝癌細(xì)胞株QGY-7701對(duì)照組相比,TNBG(濃度2.0μg/ml)處理人肝癌細(xì)胞株QGY-7701(72h)后,甘油三酯(

11、TG)水平為346.43 nmol/mg,增加的比例為69.12%,總膽固醇(TC)水平為38.99 nmol/mg,增加的比例為63.00%,游離脂肪酸(FFA)水平為159.52 nmol/mg,降低的比例為28.82%,脂質(zhì)總量(以TG、TC、FFA總量計(jì))增加的比例為20.33%;(2)與TNBG處理的人肝癌細(xì)胞株QGY-7701相比,TNBG處理“psiHIVU6-PPARγ-QGY”細(xì)胞(72h)后,TG水平為306.64

12、nmol/mg,減少的TG量占TNBG引起TG增加量的28.10%,TC水平為35.44 nmol/mg,減少的TC量占23.56%,FFA水平為168.04 nmol/mg,增加的FFA量占13.19%,由于PPARγ表達(dá)抑制,減少的脂質(zhì)總量(34.81 nmol/mg)占TNBG誘導(dǎo)的脂質(zhì)聚集總量(92.08nmol/mg)的比例為37.80%。這表明TNBG通過PPARγ途徑引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集是比較重要的途徑之一。(3)與TN

13、BG處理的人肝癌細(xì)胞株QGY-7701相比,TNBG處理“psiHIVU6-PPARγ-QGY”細(xì)胞(72h)后,脂質(zhì)聚集總量增加量(57.27 nmol/mg)占TNBG引起的脂質(zhì)聚集總量(92.08nmol/mg)的比例為62.20%。這就表明當(dāng)PPARγ表達(dá)抑制后,TNBG還可通過其他途徑引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集,并且這些途徑也具有十分重要的作用。
　　 從上述定性和定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TNBG誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集產(chǎn)生的“

14、脂毒性”是TNBG產(chǎn)生抗腫瘤作用的主要原因,TNBG所致的脂質(zhì)聚集作用可能是由激活PPARγ靶點(diǎn)以及其他靶點(diǎn)或通路(如激活SREBPs通路增加脂質(zhì)、抑制MTTP靶點(diǎn)減少脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等)等多靶點(diǎn)或多通路相互協(xié)同所致。
　　 5采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM),考察了TNBG對(duì)人肝癌細(xì)胞株QGY-7701和“psiHIVU6-PPARγ-QGY”細(xì)胞周期分布和凋亡誘導(dǎo)作用的影響。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNBG(濃度2.0μg/ml)處理(72h)后,在人肝

15、癌細(xì)胞株QGY7701和“psiHIVU6-PPARγ-QGY”細(xì)胞上均可檢測到S期細(xì)胞阻滯和凋亡現(xiàn)象,但PPARy表達(dá)抑制后TNBG引起的細(xì)胞周期阻滯和凋亡均顯著降低(P＜0.05)。由此表明TNBG誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用具有PPARγ依賴性。
　　 綜上所述,經(jīng)體內(nèi)外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明,TNBG具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性和較低的毒副作用,其抗腫瘤作用機(jī)制為通過激活PPARγ依賴性靶點(diǎn)以及其他通路或靶點(diǎn)(如激活SREBPs通