Aquaporin 3與哺乳動(dòng)物胚胎著床相關(guān)性的研究.pdf

1、目的：
　　胚泡著床是生殖過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和限速步驟，這一過(guò)程包括胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的識(shí)別、定位、黏附，進(jìn)而穿過(guò)基底膜植入到子宮內(nèi)膜。子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)受雌激素(estrogen，E2)、孕激素(progestin，P4)、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等許多因素的共同調(diào)節(jié)，使胚泡與子宮雙方發(fā)生一系列同步的變化，活化的胚胎只有在子宮內(nèi)膜進(jìn)入“著床窗口期”才能著床，此時(shí)子宮腔內(nèi)的液體減少，使游離的胚胎與子宮內(nèi)膜充分接觸，有利于胚胎黏附在子宮內(nèi)

2、膜上。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)在細(xì)胞膜上廣泛表達(dá)，完成對(duì)各種上皮和內(nèi)皮組織的液體轉(zhuǎn)運(yùn)以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定外，并參與血管生成、腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲、組織損傷修復(fù)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和免疫功能等多種重要生命活動(dòng)。有研究表明胚胎著床過(guò)程中子宮內(nèi)膜AQPs表達(dá)存在變化，但AQPs對(duì)胚胎著床調(diào)控機(jī)制并不明確。本文檢測(cè)Aquaporin3(AQP3)在小鼠不同動(dòng)情周期和自然早孕小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)及分布情況，并分析AQP3在人不同時(shí)期子宮

3、內(nèi)膜及不同接受態(tài)子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)，探討孕、雌激素對(duì)AQP3表達(dá)的影響，以及調(diào)控AQP3表達(dá)對(duì)胚胎與不同接受狀態(tài)子宮內(nèi)膜黏附、侵襲和遷移影響。明確其在胚胎著床過(guò)程中的功能及作用機(jī)制，對(duì)生殖疾病治療以及提高輔助生殖成功率具有一定意義。
　　方法：
　　(一)水通道蛋白3在不同時(shí)期小鼠子宮內(nèi)膜及蛻膜化組織中表達(dá)
　　1.用陰道涂片的方法確定小鼠的動(dòng)情周期;將不同動(dòng)情周期小鼠的子宮解剖組織用37℃PBS清洗后，拍照觀察子宮

4、大小充水情況;用免疫組化、Western blot及Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)小鼠不同動(dòng)情周期中AQP3表達(dá)與定位情況;
　　2.用免疫組化檢測(cè)小鼠妊娠D1和D5，AQP3分布及表達(dá)情況，并用Western blot及Real-time PCR分析其表達(dá)情況;
　　3.小鼠妊娠D8天，用免疫組化的方法分析小鼠著床位點(diǎn)和非著床位點(diǎn)的子宮內(nèi)膜與蛻膜組織中AQP3的分布及表達(dá)情況;
　　(二)AQP3隨月經(jīng)周期變化

5、及在胚胎著床中的機(jī)制研究
　　1.通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)AQP3在不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及分布;
　　2.通過(guò)Western blot、Real-time PCR及免疫熒光方法檢測(cè)AQP3在不同接受態(tài)子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)與分布情況;
　　3.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的AQP3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系HEC-1A細(xì)胞(低接受態(tài)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的AQP3干擾質(zhì)粒(AQP3-siRNA)轉(zhuǎn)

6、染到人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系RL95-2細(xì)胞(高接受態(tài)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞);
　　4.通過(guò)Transwell小室、細(xì)胞劃痕檢測(cè)AQP3對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和遷移的影響;用JAR細(xì)胞模擬胚胎，通過(guò)黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AQP3對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞與胚胎細(xì)胞之間黏附情況;
　　5.通過(guò)Western blot、Real-time PCR檢測(cè)用不同濃度孕激素、雌激素和卵巢類(lèi)固醇類(lèi)激素對(duì)AQP3基因及蛋白表達(dá)的影響;
　　6.通過(guò)Western blo

7、t檢測(cè)，E2P4通過(guò)AQP3介導(dǎo)RL95-2細(xì)胞發(fā)生EMT;通過(guò)細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)分析卵巢類(lèi)固醇激素通過(guò)AQP3介導(dǎo)RL95-2細(xì)胞的遷移和侵襲;
　　7.通過(guò)免疫共沉淀和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AQP3與Ezrin之間的相互作用;通過(guò)Western blot、Real-time PCR檢測(cè)，卵巢類(lèi)固醇激素和AQP3-siRNA作用RL95-2細(xì)胞后，檢測(cè)AQP3和Ezrin之間調(diào)控關(guān)系;
　　8.鬼筆環(huán)肽染色，通過(guò)熒

8、光檢測(cè)，AQP3與細(xì)胞骨架之間的調(diào)控關(guān)系;通過(guò)免疫熒光檢測(cè)AQP3與Ezrin之間的調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　(一)水通道蛋白3在不同時(shí)期小鼠子宮內(nèi)膜及蛻膜化組織中表達(dá)
　　1.AQP3在小鼠動(dòng)情周期過(guò)程中，主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜基質(zhì)中，子宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞無(wú)表達(dá)。主要表達(dá)在小鼠動(dòng)情前期和動(dòng)情期，后期最少;在小鼠的動(dòng)情前期和動(dòng)情期子宮腫大充水且子宮腔隙大，后期和間期子宮細(xì)長(zhǎng)，基本無(wú)空隙，后期尤為突出;
　　2

9、.AQP3主要表達(dá)在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)中，在子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮無(wú)表達(dá)，在妊娠小鼠D5的AQP3的表達(dá)量比妊娠D1天的表達(dá)量高。并且在小鼠妊娠D5，圍繞子宮內(nèi)膜腔的基質(zhì)中表達(dá)量比子宮壁周?chē)磉_(dá)量高;
　　3.在妊娠小鼠D8，AQP3在著床位點(diǎn)的子宮內(nèi)膜中及蛻膜組織無(wú)表達(dá)，在非著床位點(diǎn)的子宮內(nèi)膜和肌層有較高表達(dá)。
　　(二)AQP3隨月經(jīng)周期變化及在胚胎著床中的機(jī)制研究
　　1.AQP3主要表達(dá)在人月經(jīng)周期的分泌中期和分

10、泌晚期的腔上皮和腺上皮細(xì)胞的基底側(cè)，分泌中期表達(dá)量出現(xiàn)峰值;
　　2.AQP3表達(dá)量在RL95-2細(xì)胞中的表達(dá)量高于HEC-1A細(xì)胞;
　　3.通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)HEC-1A細(xì)胞的AQP3的表達(dá);質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)RL95-2細(xì)胞的AQP3的表達(dá)
　　4.AQP3促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，對(duì)黏附無(wú)影響;
　　5.孕激素能夠上調(diào)AQP3的表達(dá)，低劑量的雌激素能上調(diào)AQP3的表達(dá)，高劑量的雌激素?zé)o作用甚至能抑制AQP3的表達(dá)，E

11、2P4比同劑量的孕激素、雌激素單獨(dú)作用，對(duì)AQP3表達(dá)的促進(jìn)作用更為明顯;
　　6.卵巢類(lèi)固醇激素通過(guò)AQP3介導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞(RL95-2細(xì)胞)發(fā)生EMT，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲;
　　7.通過(guò)免疫共沉淀和免疫熒光檢測(cè)到AQP3與Ezrin之間存在相互作用;AQP3與Ezrin之間不存在表達(dá)量上的調(diào)控關(guān)系;
　　8.卵巢類(lèi)固醇激素通過(guò)AQP3促進(jìn)細(xì)胞骨架中絲狀偽足、板狀偽足的形成和應(yīng)力纖維的重構(gòu);卵巢類(lèi)固醇激素通過(guò)AQ

12、P3影響Ezrin在細(xì)胞中的分布。
　　結(jié)論：
　　(一)水通道蛋白3在不同時(shí)期小鼠子宮內(nèi)膜及蛻膜化組織中表達(dá)
　　1.AQP3能夠負(fù)責(zé)子宮腔水分子的雙向轉(zhuǎn)運(yùn);
　　2.AQP3在著床窗口期高表達(dá)，可能對(duì)于胚胎著床起正向調(diào)控作用;
　　3.推斷AQP3在蛻膜化過(guò)程無(wú)作用，但可以促進(jìn)子宮鎖的形成。
　　(二)AQP3隨月經(jīng)周期變化及在胚胎著床中的機(jī)制研究
　　1.AQP3在著床窗口期的人子宮內(nèi)膜中

13、表達(dá)出現(xiàn)峰值，并且在高接受態(tài)子宮內(nèi)膜細(xì)胞系RL95-2中表達(dá)高于低接受態(tài)子宮內(nèi)膜細(xì)胞系HEC-1A，提示AQP3可能作為子宮內(nèi)膜接受態(tài)標(biāo)志物，并且對(duì)于胚胎著床過(guò)程起到一定作用;
　　2.AQP3通過(guò)影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和遷移促進(jìn)胚胎著床的順利進(jìn)行，對(duì)其黏附過(guò)程無(wú)明顯作用;
　　3.雌、孕激素聯(lián)合作用于子宮內(nèi)膜細(xì)胞促進(jìn)AQP3的表達(dá);
　　4.E2P4通過(guò)AQP3介導(dǎo)的EMT促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和遷移;
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