新型n-糖酰胺酶PNGase H+的克隆表達與特性研究.pdf

1、糖組學(xué)研究是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的一個新的生物學(xué)研究熱點，其中糖蛋白質(zhì)聚糖是糖組學(xué)研究的重中之重。N-糖酰胺酶(PNGase)是糖蛋白N-連接糖基化研究中主要的工具酶，其作用是將糖鏈從所連接的蛋白質(zhì)分子上釋放下來進行分析，被廣泛用于糖鏈結(jié)構(gòu)信息、糖鏈結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、糖鏈對糖蛋白功能的影響以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等方面的研究。目前廣泛使用的商業(yè)化N-糖酰胺酶主要有兩種:PNGase F和PNGase A，但是這兩種酶在使用中都有各自不可克

2、服的缺點，不能完全滿足糖組學(xué)飛速發(fā)展的需要。因此通過進一步的挖掘和篩選，開發(fā)出不具備自身糖基修飾、能夠使用原核系統(tǒng)進行表達、且能最大限度酶切不同糖鏈結(jié)構(gòu)的新N-糖酰胺酶，是糖組學(xué)研究發(fā)展的必然需求。
　　本研究從細菌Terriglobus roseus中發(fā)現(xiàn)了一種編碼新型N-糖酰胺酶PNGase H+的基因，并對該基因進行了分子克隆和體外重組表達，并對重組表達的PNGase H+的活性及酶學(xué)特性進行了研究。具體內(nèi)容如下:
　

3、　1.本研究從酸桿菌屬Terriglobus roseus DSM18391中發(fā)現(xiàn)了一種新型的N-糖酰胺酶PNGase H+基因，并對其進行了基因克隆。將獲得的PNGase H+基因連接到pET30a載體上，然后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，得到含有重組PNGase H+質(zhì)粒的工程菌。在特定的條件下對此工程菌進行了培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達，進而通過Ni-NTA親和層析柱進行分離純化，得到了純度較高的重組PNGaes H+酶。
　

4、　2.為了確定重組蛋白的活性，本研究以商業(yè)化的PNGase F為對照，以核心結(jié)構(gòu)含有α1，3-巖藻糖的糖蛋白HRP為底物，利用超高效液相進行活性初測，證明重組蛋白具有N-糖酰胺酶A樣活性。以熒光標(biāo)記的糖肽GNGN為底物建立了基于超高效液相的酶活性檢測方法。在對重組PNGase H+酶學(xué)特性進行研究的過程中，發(fā)現(xiàn)重組PNGase H+酶的最適pH為2.6，最適反應(yīng)溫度為30℃，重組PNGase H+酶無任何金屬離子依賴性，而大部分常用的表

5、面活性劑會影響其活力。
　　3.對重組PNGase H+酶的底物特異性研究顯示:重組PNGase H+酶既可像PNGaseF一樣作用于哺乳動物來源的高甘露糖型、復(fù)合型以及雜合型N-糖鏈，又可如PNGaseA一樣作用于植物來源具有核心α1，3-巖藻糖連接的N-糖鏈，并克服了PNGase A不能直接作用于糖蛋白的缺點。此外，在作用于植物來源的糖蛋白時，其對不合有核心α1，3-巖藻糖的N-糖鏈的酶解效率要高于PNGase F。