糞類圓線蟲RIOK--2蛋白激酶編碼基因的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、寄生線蟲不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，而且還可以感染人，嚴重影響人類的健康。WHO組織評估全球有超過10億人口感染寄生線蟲，在傷殘調(diào)整生命年中，寄生線蟲的影響超過了糖尿病和肺癌患者。大規(guī)模和長期抗寄生蟲藥物的使用已經(jīng)誘導(dǎo)出寄生蟲抗藥性的產(chǎn)生，因此新藥的開發(fā)迫在眉睫，而新型抗寄生線蟲藥物以及疫苗的研發(fā)需要對寄生線蟲發(fā)育過程中關(guān)鍵基因的功能進行深入研究。蛋白激酶在寄生線蟲發(fā)育生物學(xué)和生殖發(fā)育學(xué)等過程中發(fā)揮著重要作用，以蛋白激酶作為藥物靶標(biāo)

2、治療疾病的研究已有報道，但在寄生線蟲中的研究還寥寥無幾。
　　RIOK-2蛋白激酶是一種新發(fā)現(xiàn)的非典型蛋白激酶，在酵母和人細胞核糖體生物合成、細胞周期調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用。盡管如此，該分子在線蟲中的功能還所知甚少。本項目選取人獸共患寄生線蟲糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)作為研究對象，從結(jié)構(gòu)和功能兩方面對糞類圓線蟲RIOK-2蛋白激酶編碼基因Ss-riok-2進行了研究;同時利用模式生物自由生

3、活的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的轉(zhuǎn)基因和RNAi技術(shù)研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶編碼基因Ce-riok-2的功能。
　?。ㄒ唬┘S類圓線蟲Ss-RIOK-2蛋白激酶編碼基因的結(jié)構(gòu)分析
　　本研究通過RACE-PCR獲得了Ss-riok-2基因的cDNA序列，其中編碼區(qū)為1572bp，共編碼523個氨基酸。通過氨基酸比對發(fā)現(xiàn)編碼的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能結(jié)構(gòu)域。利用生物信息學(xué)軟件

4、對Ss-RIOK-2蛋白三級結(jié)構(gòu)進行同源建模，預(yù)測了Ss-RIOK-2蛋白與ATP、金屬離子結(jié)合的關(guān)鍵活性位點，為開發(fā)以RIOK-2蛋白作為潛在的抗寄生蟲藥物靶標(biāo)奠定理論基礎(chǔ)。通過Genomewalker PCR獲得Ss-riok-2基因的gDNA，其長度為1620bp，包含一個48bp的內(nèi)含子。預(yù)測的Ss-riok-2基因啟動子序列全長1308bp，含有真核生物保守的調(diào)控元件。
　　（二）糞類圓線蟲Ss-RIOK-2蛋白激酶編碼

5、基因的表達、轉(zhuǎn)錄水平及定位分析
　　體外原核表達和純化了Ss-RIOK-2融合蛋白，進一步的激酶活性實驗驗證了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通過轉(zhuǎn)錄組分析，Ss-riok-2基因在蟲體各個階段都有轉(zhuǎn)錄且在寄生雌蟲中最高。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灡砻鱏s-riok-2基因啟動子可以驅(qū)動gfp基因表達在F1代幼蟲的腸道組織。
　　（三）秀麗隱桿線蟲Ce-RIOK-2蛋白激酶編碼基因的功能分析
　　預(yù)測的Ce-riok-2

6、基因啟動子序列全長1269bp，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灡砻鰿e-riok-2基因啟動子也可以驅(qū)動gfp基因表達在F1代幼蟲的腸道組織。當(dāng)幼蟲進入deaur時期時表達減弱。反轉(zhuǎn)錄PCR檢測到Ce-riok-2基因在性腺組織中也有轉(zhuǎn)錄。通過dsRNA飼喂法干擾Ce-riok-2基因在秀麗隱桿線蟲中的表達，結(jié)果導(dǎo)致Ce-riok-2基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，同時引起Ce-vit-2基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)且導(dǎo)致蟲體發(fā)生以下表型變化:1.蟲體的發(fā)育減慢;2.蟲體不育;3.