植物凝集素類受體蛋白激酶LecRK-b2的生物信息學(xué)分析及基因功能研究.pdf

1、植物凝集素蛋白激酶(LecRK)是植物體內(nèi)廣泛存在的一類類受體蛋白激酶,一般認(rèn)為它們參與了多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和糖信號(hào)的識(shí)別,但是迄今為止對(duì)其具體基因功能的研究非常少,大部分基因功能未知。因此,本文對(duì)植物凝集素類受體蛋白激酶LecRK-b2開展了生物信息學(xué)分析及基因功能研究,獲得了如下主要研究結(jié)果:
　　 (1)利用生物信息學(xué)方法分析了LecRK-b2的核酸及其編碼氨基酸序列,利用同源建模方法構(gòu)建了LecRK-b2蛋白N端凝集素受體結(jié)構(gòu)

2、域的三維結(jié)構(gòu)模型。研究發(fā)現(xiàn)LecRK-b2蛋白包含三個(gè)功能域:N端為大豆凝集素類似的配體識(shí)別功能域,中間為跨膜結(jié)構(gòu)域,C端為絲/蘇氨酸激酶功能域。疏水性分析表明LecRK-b2蛋白屬于親水性蛋白。三維結(jié)構(gòu)模型顯示LecRK-b2蛋白的N端Lectin功能域與現(xiàn)已測定結(jié)構(gòu)的植物凝集素有非常相似的β-折疊和與碳水化合物結(jié)合的位點(diǎn)。plantCARE分析表明LecRK-b2基因的調(diào)控區(qū)域存在大量激素響應(yīng)相關(guān)的元件以及與脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的元件。PR

3、OSCAN預(yù)測發(fā)現(xiàn)LecRK-b2蛋白可能含有19個(gè)磷酸化位點(diǎn),1個(gè)絲蘇氨酸蛋白磷酸化活性位點(diǎn),2個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn);初步判斷LecRK-b2蛋白屬于絲蘇氨酸蛋白激酶。
　　 (2)闡明了LecRK-b2基因的時(shí)空表達(dá)特性及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位,并初步了解了LecRK-62基因在脅迫應(yīng)答過程中所發(fā)揮的作用。RT-PCR分析結(jié)果顯示:LecRK-b2基因在野生型擬南芥的各個(gè)組織器官的表達(dá)量都非常低,但是在種子萌發(fā)的初期其表達(dá)量明顯

4、上升。ABA、NaCl、甘露醇、水楊酸、機(jī)械損傷、衰老都能使LecRK-b2基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,說明LecRK-b2基因的轉(zhuǎn)錄受環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)。GFP融合蛋白的分析顯示,ecRK-b2蛋白定位在細(xì)胞膜上。Promoter::GUS試驗(yàn)結(jié)果表明所克隆的LecRK-b2基因上游的904bp的片段具有完整啟動(dòng)子的活性,具有時(shí)空表達(dá)的特異性,它控制LecRK-b2基因在種子萌發(fā)過程中高水平表達(dá),而在成年植株中則基本不表達(dá)。
　　 比

5、較LecRK-b2基因的T-DNA插入突變體(lecrk-b2)和野生型種子在不同濃度ABA培養(yǎng)基上的萌發(fā)率后,發(fā)現(xiàn)lecrk-b2種子的萌發(fā)對(duì)ABA不敏感。此外,研究發(fā)現(xiàn)lecrk-b2和野生型種子中ABA含量沒有明顯差異,lecrk-b2的種子萌發(fā)和幼苗的根伸長對(duì)鹽脅迫、滲透脅迫也呈現(xiàn)出不敏感表型。
　　 構(gòu)建了35S::LecRK-b2過表達(dá)載體,并用浸花蕾法轉(zhuǎn)化SALK020262的純合子株系lecrk-b2,獲得了轉(zhuǎn)基

6、因的植株。萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因株系與野生型的種子在不同濃度ABA培養(yǎng)基上的萌發(fā)沒有明顯差異,表明在T-DNA插入突變體lecrk-b2中過表達(dá)LecRK-62基因能夠恢復(fù)到野生型表型,從而證實(shí)是LecRK-b2基因的缺失導(dǎo)致了lecrk-62的種子萌發(fā)對(duì)ABA不敏感。
　　 (3)發(fā)現(xiàn)ABI3正調(diào)控LecRK-b2基因的轉(zhuǎn)錄。雙亮熒光分析結(jié)果顯示,瞬時(shí)過量表達(dá)的ABI3蛋白能夠在擬南芥體內(nèi)激活與LecRK-b2基因的啟動(dòng)子序

7、列結(jié)合,并啟動(dòng)與之相連接的LUC的表達(dá)。通過對(duì)LecRK-b2基因的啟動(dòng)子序列調(diào)控元件分析,發(fā)現(xiàn)LecRK-b2基因的啟動(dòng)子序列中存在一個(gè)ABI3的結(jié)合元件RY/G基序。此外,定量PCR結(jié)果顯示,在種子萌發(fā)過程中abi3突變體中LecRK-b2基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低。上述結(jié)果表明ABI3是LecRK-b2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子之一。
　　 (4)利用體外重組蛋白證實(shí)了LecRK-b2蛋白的絲/蘇氨酸激酶活性。利用pColdTF載體對(duì)

8、LecRK-b2基因編碼蛋白進(jìn)行了大腸桿菌表達(dá),純化得到了大量可溶的重組蛋白。利用同位素磷32標(biāo)記的三磷酸腺苷([γ-32P]ATP)鑒定了重組蛋白的自激活活性,發(fā)現(xiàn)LecRK-b2的重組蛋白具有二價(jià)錳離子依賴的自激活激酶活性。將磷32標(biāo)記了的LecRK-b2重組蛋白完全水解,通過薄層色譜(TLC)分析,發(fā)現(xiàn)重組蛋白的絲氨酸和蘇氨酸在自我磷酸化過程中被磷酸化,表明LecRK-b2屬于絲/蘇氨酸激酶。
　　 (5)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表

9、明LecRK-b2蛋白重組蛋白以二聚體的形式存在。體外pulldown實(shí)驗(yàn)顯示LecRK-b2蛋白的Lectin結(jié)構(gòu)域和全長蛋白自身及其兩者之間均能相互作用,而C端激酶功能域自身則不能相互作用。酵母雙雜交結(jié)果顯示Lectin結(jié)構(gòu)域能夠相互作用,而C端激酶功能域也不能相互作用,這與體外Pulldown的結(jié)果一致。進(jìn)一步通過裂解熒光素酶互補(bǔ)分析,發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)LecRK-b2蛋白的N端及其全長存在相互作用。這些結(jié)果表明:LecRK-b2受體蛋白