擬南芥類蛋白激酶基因AtACDO1調控葉綠素降解及抗氧化的研究.pdf

1、ABC1（for Activity of bcl complex）類蛋白激酶是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的一類新的非典型性激酶。自被發(fā)現(xiàn)之始，就漸成為人們關注的熱點，但植物中該激酶的研究較少，對于其在植物中的功能更相知甚少。本實驗室在擬南芥中克隆到一個編碼ABC1類蛋白激酶的基因，AtACDO1（ABC1-like Kinase related to Chlorophyll Degradation and Oxidative stress），在

2、對擬南芥和水稻ABC1基因家族成員進行了生物信息學分析和表達模式的整體研究基礎上，進一步對擬南芥AtACDO1基因的功能進行了深入研究，著重探討該基因在葉綠素代謝以及抗氧化脅迫方面的作用，并探究了其可能的作用機理。主要取得了以下結果：
　　 1、擬南芥和水稻ABC1類蛋白激酶家族生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中該家族有17個成員（AtABC1P1-AtABC1P17）；水稻種有15個成員（OsABC1P1-OsABC1P15）。該

3、家族所有成員在蛋白質序列上含有一個典型的ABC1結構域，并且具有激酶保守的VAVK-like和DFG-like催化基序。所有32個成員在進化上可分為3個亞家族，同時發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥成員間的進化關系較各自物種本身成員之間更近。亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)該家族成員大多定位于葉綠體或線粒體。
　　 2.利用RT-PCR分析了擬南芥和水稻中該家族成員在不同脅迫條件下的基因表達水平。結果顯示，在高光下AtABC1P2、AtABC1P5、AtABC

4、1P17、OsABC1P7、和OsABC1P8表達水平上調；而除了AtABC1P2外，幾乎所有AtABC1Ps均在高溫處理時表達水平下降。AtABC1P15和OsABC1P8表達受ABA誘導，而AtABC1P17、OsABC1P1、OsABC1P2以及OsABC1P13的表達水平被ABA下調。大部分AtABC1Ps受CdCl2短時誘導；而大部分OsABC1Ps在NaCl處理時，表達下調。同時，大部分AtABC1Ps受SA誘導，而OsAB

5、C1Ps則對SA沒有響應。
　　 3、RT-PCR檢測了AtACDO1基因在擬南芥不同組織和器官中表達水平。結果表明該基因在擬南芥的根、莖、葉、花、角果等組織中均有表達，且葉片中表達最強。這與利用AtACDO1基因的啟動子驅動GUS報告基因的研究結果相一致。AtACDO1-GFP轉化植物后提取原生質體，用共聚焦激光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)AtACDO1定位于葉綠體。
　　 4、表型分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtACDO1敲減轉基因植株（At

6、ACDO1 RNAi）在正常培養(yǎng)條件下葉片泛黃，且葉片長度、寬度以及葉面積變小，但是單位面積葉片鮮重不變。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，AtACDO1 RNAi株系中葉綠素和類胡蘿卜素（新黃質、紫黃質、葉黃素和β-胡蘿卜素）含量顯著低于野生型，且兩種色素者呈一定比例減少，但透射電鏡觀察葉綠體和線粒體超微結構未發(fā)現(xiàn)其在AtACDO1 RNAi株系與野生型有差異。NB-PAGE和蔗糖梯度離心分析光系統(tǒng)復合物，結果發(fā)現(xiàn)在AtACDO1 RNAi株系與野生

7、型中二者亦無明顯差異。
　　 5、不同的生長時期（10、20或30 d）、不同光強（10、40、80或120 μmolm-2s-1）以及不同光質（白光、藍光、紅光以及遠紅光）條件下，AtACDO1 RNAi植株中葉綠素含量均顯著低于野生型；且在生長第10 d、和20 d以及紅光下差異最為明顯。在黑暗誘導的衰老過程中，AtACDO1 RNAi植株中葉綠素含量顯著低于野生型，但AtACDO1敲減轉基因植株中葉綠素降解速度較野生型慢。

8、
　　 6、在不同光強下培養(yǎng)的擬南芥，AtACDO1 RNAi植株中類胡蘿卜素含量在光強為10 μmolm-1s-1時高于野生型，在其他光強下均低于野生型。
　　 7、AtACDO1 RNAi株系幼苗在去黃化過程中葉綠素的合成速度與野生型中無明顯差異，且在正常生長的植株葉片中葉綠素合成前體Pchlide與野生型間無差異
　　 8、AtACDO1 RNAi株系中，編碼葉綠素代謝酶的基因，包括HEMC、CHLH、CH

9、LD、DVR、PORA、PORB、PORC、CAO、LH1、CLH2、ACD1和ACD2以及類胡蘿卜素代謝基因ZDS和PDS在不同生長時期以及不同光強下的表達與野生型之間均不存在差異，但AtACDO1 RNAi株系中葉綠素酶活性顯著高于野生型，且積累降解產物Chlide和Pheide。
　　 9、在正常培養(yǎng)條件下AtACDO1 RNAi植株光合放氧速率顯著低于野生型，但光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學效率（Fv/Fm）、光系統(tǒng)Ⅱ實際光化學效率

10、ФPSⅡ、非光化學淬滅（NPQ）以及電子傳遞速率（ETR）與野生型之間沒有差異。在高光脅迫下FV/Fm低于卻低于野生型，但光系統(tǒng)Ⅱ恢復略快。
　　 10、非生物脅迫處理發(fā)現(xiàn)，在NaCl（120 mM）、甘露醇（300 mM）以及葡萄糖（300 mM）處理下，AtACDO1 RNAi株系萌發(fā)率與野生型之間沒有差異。在120 mM NaCl、120 mM KCl、100 mM KNO3、100 mMNaNO3以及15 μM CdCl

11、2條件下培養(yǎng)的AMCDO1 RNAi、Co1-0和35S：：AMCDO1株系幼苗中葉綠素含量均較正常條件下降低，尤以NaCl和KCl培養(yǎng)條件下最甚。氧化脅迫實驗發(fā)現(xiàn)，正常條件培養(yǎng)20d左右植株的葉片卻對氧化脅迫敏感，體內積累更多H2O2；在連續(xù)高光（300 μmolm-2s-1）下培養(yǎng)7d的AtACDO1 RNAi植株葉片壞死情況較野生型嚴重，其葉片中花色素苷顯著低于野生型；且AtACDO1受MV誘導；敲減植株葉片對MV敏感，CSD1，