通痹湯治療痛風(fēng)病藥效學(xué)研究及其含藥血清的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：以中醫(yī)理論為指導(dǎo),總結(jié)痛風(fēng)病的中醫(yī)認(rèn)識(shí)、分析通痹湯的方義;觀察通痹湯對(duì)模型動(dòng)物的抗炎、鎮(zhèn)痛及嘌呤代謝的影響并探討機(jī)理;觀察通痹湯含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響;觀察含藥血清對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫功能的影響;觀察含藥血清對(duì)CD4+T細(xì)胞亞型(Th1/Th2)的影響。
　　 方法:
　　 1.通過理論研究,闡述痛風(fēng)病的病因病機(jī)、探討其治則治法。
　　 2.通痹湯鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 (1)觀察藥物對(duì)小

2、鼠化學(xué)性痛的影響:通過醋酸誘發(fā)小鼠腹痛,觀察各藥物劑量組與鹽酸嗎啡組、空白組的扭體次數(shù)、扭體抑制率;
　　 (2)觀察藥物對(duì)小鼠熱性痛的影響:通過熱板誘發(fā)小鼠熱性痛,觀察各藥物劑量組與鹽酸嗎啡組、空白組的痛閾值;
　　 3.通痹湯抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 (1)觀察藥物對(duì)急性化學(xué)致炎癥的影響:通過二甲苯注射制備小鼠耳腫脹模型,比較各藥物劑量組與消炎痛組、空白組的腫脹抑制率;
　　 (2)觀察藥物對(duì)急性炎癥

3、介質(zhì)的影響:通過角叉菜注射制備大鼠足跖腫脹模型,比較各藥物劑量組與醋酸地塞米松組、空白組的致炎后足跖腫脹率、組織滲出液炎性介質(zhì)含量(Histamine、5-HT、PGE2);
　　 (3)觀察藥物對(duì)慢性炎癥的影響:通過皮下棉球植入制備大鼠慢性肉芽腫模型,比較各藥物劑量組與醋酸地塞米松組、空白組的肉芽腫重量;
　　 (4)觀察藥物對(duì)毛細(xì)血管通透性的影響:通過小鼠腹腔色素滲出實(shí)驗(yàn),觀察各藥物劑量組與PNS組、空白組腹腔液的O

4、D值。
　　 4.通痹湯影響嘌呤代謝的實(shí)驗(yàn)研究。通過高核蛋白、高鈣飼料飼服制備雞痛風(fēng)模型,以ELISA法檢測(cè),比較各藥物劑量組與別嘌呤醇組、空白組血尿酸水平、糞便尿酸含量、血清黃嘌呤氧化酶(XOD)活性。
　　 5.通痹湯對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用的實(shí)驗(yàn)研究。通過尿酸鈉溶液注射制備大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型,比較各藥物劑量組與秋水仙堿組、空白組關(guān)節(jié)腫脹的影響、滑膜細(xì)胞因子表達(dá)。
　　 6.通痹湯含藥血清免疫調(diào)節(jié)作用研究

5、。
　　 (1)含藥血清對(duì)固有性免疫的作用。以大鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察藥物對(duì)其功能的影響:免疫酶技術(shù)檢測(cè)含藥血清對(duì)sTNF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)現(xiàn)象的影響;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)含藥血清對(duì)sTNF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)的影響;激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)含藥血清對(duì)sTNF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NF-κB(P65)核轉(zhuǎn)位的影響;小鼠碳粒廓清法檢測(cè)含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響;
　　 (2)含

6、藥血清對(duì)適應(yīng)性體液免疫功能的作用:美洲商陸誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、sRBC誘導(dǎo)的小鼠抗體應(yīng)答實(shí)驗(yàn);
　　 (3)含藥血清對(duì)適應(yīng)性細(xì)胞免疫功能的作用:刀豆蛋白A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、DNCB-丙酮溶液誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn);
　　 (4)含藥血清對(duì)CD4+T細(xì)胞亞型(Th1/Th2)的影響:通過ELISA法檢測(cè)不同時(shí)相關(guān)節(jié)滑膜囊細(xì)胞因子的種類和含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.理論研究結(jié)果:脾虛不運(yùn)、

7、濕濁為患是痛風(fēng)病的重要病機(jī)。
　　 2.通痹湯鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 急性毒性實(shí)驗(yàn)確定用藥安全劑量為:小鼠用藥量:高劑量組25g/kg,中劑量組為12g,低劑量組為6g。大鼠用量約為小鼠劑量×0.7,即為高劑量組18g/kg、中劑量組為9g/kg、低劑量組為4g/kg;藥物對(duì)醋酸誘發(fā)小鼠腹痛的影響結(jié)果顯示治療組低、中、高劑量組均可見扭體次數(shù)減少,與陰性對(duì)照組比較具明顯差異(P＜0.001);熱板法檢測(cè)藥物對(duì)小鼠熱致疼

8、痛作用的影響結(jié)果顯示測(cè)得治療組痛閾平均值與陰性對(duì)照組相比顯著提高(P＜0.01);甲醛測(cè)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通痹湯對(duì)甲醛致痛作用第一時(shí)相(即5min時(shí))和第二時(shí)相(15min、30min)的疼痛反應(yīng)評(píng)分值均出現(xiàn)降低。
　　 3.通痹湯抗炎作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組與空白組比較均有顯著性差異(P＜0.01～0.001)且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性;角叉菜所致大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示致炎后1h,藥物大劑量組;致

9、炎后2h藥物中、大劑量組;致炎后4h、6h藥物大、中、小劑量組抑制率均大于30％,其中大劑量組在4小時(shí)左右抑制能力最強(qiáng)為50.31%;炎癥組織滲出液內(nèi)炎癥介質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果顯示治療組組織滲出液內(nèi)組織胺含量顯著降低;藥物高劑量組前列腺素2、5-HT含量顯著降低(P＜0.05);小鼠腹腔色素滲出實(shí)驗(yàn)結(jié)果示各給藥組均能降低依文思蘭的吸光度(OD值);大鼠棉球植入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通痹湯中高劑量組可明顯抑制大鼠肉芽組織增生(P＜0.001)。

10、　　 4.通痹湯影響嘌呤代謝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 雞痛風(fēng)癥動(dòng)物模型血尿酸水平的影響結(jié)果顯示治療組血尿酸值均顯著降低,與治療前相比均有顯著性差異(P＜0.05),治療后通痹湯高、中、低劑量組糞便中尿酸排泄量均顯著增高,與治療前相比均具顯著性差異;對(duì)雞痛風(fēng)動(dòng)物模型血清XOD活性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各劑量組XOD活性降低,其中中、高劑量組與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)。低劑量組無(wú)顯著差異。
　　 5.通痹湯對(duì)急性痛風(fēng)

11、性關(guān)節(jié)炎作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 藥物對(duì)大鼠尿酸鈉誘發(fā)急性炎關(guān)節(jié)腫脹的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在注射后的2h、4h、8h、12h、24h檢測(cè)時(shí)段,藥物治療組腫脹率明顯減小,藥物組最高抑制率達(dá)68.6%(高劑量組,24小時(shí))所用藥物兩劑量組之間的療效無(wú)顯著性差異。檢測(cè)滑膜炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)結(jié)果顯示秋水仙堿組(陽(yáng)性對(duì)照組)、治療組IL-1β RT-PCR產(chǎn)物量明顯低于生理鹽水組。而通過密度掃描進(jìn)行相對(duì)定量,證實(shí)治療組的抑制效率為50%;

12、治療組Ⅰ和治療組Ⅱ均可見TNF-α特異性RT-PCR產(chǎn)物條帶顯示,但產(chǎn)物表達(dá)量較生理鹽水組明顯減少。通過密度掃描進(jìn)行相對(duì)定量,證實(shí)治療組的抑制率為30%。
　　 6.通痹湯含藥血清免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 (1)含藥血清對(duì)固有性免疫的作用:
　　 結(jié)果顯示10%濃度含藥血清可明顯抑制sTNF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā),而20%含藥血清的抑制作用最強(qiáng);檢測(cè)含藥血清對(duì)sTNF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-1βmRNA和TNF

13、-αmRNA的影響結(jié)果顯示治療組IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達(dá)明顯降低;含藥血清能抑制sTNF誘導(dǎo)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,但不同劑量含藥血清組間未見差異;單核吞噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定結(jié)果顯示含藥血清低劑量組和中藥水劑低劑量組K值變化與生理鹽水對(duì)照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而含藥血清高劑量組和中藥水劑高劑量組K值增加(P＜0.05)。
　　 (2)含藥血清對(duì)適應(yīng)性體液免疫功能的作用:
　　 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)

14、驗(yàn)結(jié)果顯示含藥血清對(duì)PWM誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)增高,提示有細(xì)胞增殖,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(p＞0.05);測(cè)定含藥血清對(duì)小鼠sRBC初次應(yīng)答的水平的影響,將給藥組與對(duì)照組平均HC50值進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果顯示,藥物中、高劑量組HC50增高(*P＜0.05)。
　　 (3)含藥血清對(duì)適應(yīng)性細(xì)胞免疫功能的作用:
　　 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見不同濃度含藥血清可劑量依賴性抑制T細(xì)胞增殖(p＜0.05);含藥血清對(duì)DNCB誘導(dǎo)的遲發(fā)

15、性超敏反應(yīng)具有顯著劑量依賴性的抑制作用。
　　 (4)含藥血清對(duì)CD4+T細(xì)胞類型(Th1/Th2)的影響:
　　 ELESA檢測(cè)不同時(shí)相細(xì)胞因子水平顯示與正常組比較TNF隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,在24h達(dá)高峰,此后逐漸下降。IL-2于造模12h始顯著增高,48h后開始下降;造模24h IL-4,IL-13顯著增高。與模型組比較,藥物組TNF、IL-2表達(dá)顯著降低,IL-4,IL-13顯著增高(P＜0.05)。