解淀粉芽孢桿菌SQR9增強(qiáng)植物耐鹽能力的機(jī)制研究.pdf

1、目前，世界上有20％的耕地受到鹽害的影響，過(guò)量的鹽分會(huì)影響作物生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，嚴(yán)重限制農(nóng)作物的產(chǎn)出。鹽害除了會(huì)導(dǎo)致植物離子毒害和滲透脅迫，還會(huì)引起氧化傷害，因此有必要采取一些有效措施來(lái)增強(qiáng)植物的耐鹽能力，其中根際促生菌(PGPR)被認(rèn)為可以有效增強(qiáng)植物耐鹽脅迫能力。解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）SQR9是本實(shí)驗(yàn)室在健康黃瓜根際篩選到的一株根際促生菌，可以顯著地促進(jìn)黃瓜植物的生長(zhǎng)。以SQR9為添加

2、菌劑的生物有機(jī)肥可以有效地促進(jìn)植物生長(zhǎng)，抑制土傳病害的發(fā)生。
　　本文發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌SQR9不僅對(duì)植物有促生作用，還可以顯著的增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力。通過(guò)研究接種SQR9對(duì)鹽脅迫下植物耐鹽相關(guān)生理指標(biāo)和基因轉(zhuǎn)錄的影響，初步確定SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的途徑。通過(guò)對(duì)SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的信號(hào)物質(zhì)的研究及擬南芥突變體驗(yàn)證，確定了SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的主要途徑，并發(fā)現(xiàn)亞精胺為SQR9產(chǎn)生的誘導(dǎo)植物耐鹽的重要信號(hào)物質(zhì)。獲得

3、如下主要結(jié)果:
　　在水培和瓊脂培養(yǎng)條件下，解淀粉芽孢桿菌SQR9可以增強(qiáng)玉米、水稻和擬南芥三種作物在不同鹽濃度下的耐鹽能力。在100 mM NaCl下，接種SQR9的玉米的莖葉和根部鮮重分別是對(duì)照組玉米的2.69倍和1.78倍，接種SQR9的擬南芥的莖葉和根部鮮重分別是對(duì)照組的2.85倍和1.9倍，且接種SQR9導(dǎo)致植物根部側(cè)根的數(shù)量顯著增加。
　　在鹽脅迫下，SQR9可以通過(guò)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)來(lái)影響植物相關(guān)生理指標(biāo)，如葉

4、綠素、光合速率、脫落酸(ABA)、滲透調(diào)節(jié)物可溶性總糖(TSS)、抗氧化物酶、還原型谷胱甘肽(GSH)和Na+含量。RBCS和RBCL是植物光合作用關(guān)鍵基因，SQR9可以通過(guò)提高玉米內(nèi)的ZmRBCS、ZmRBCL基因和擬南芥內(nèi)AtRBCS、AtRBCL基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)增強(qiáng)植物光合作用。同時(shí)在鹽脅迫下，SQR9接種的玉米葉綠素和類胡蘿卜素含量分別是未接種對(duì)照的1.84和1.44倍，而接種SQR9的擬南芥葉綠素和類胡蘿卜素分別是對(duì)照組的3.

5、39倍和3.35倍，同時(shí)在鹽脅迫下SQR9的接種顯著增強(qiáng)了玉米和擬南芥的光合速率。在鹽害下，植物會(huì)通過(guò)提高ABA含量來(lái)調(diào)控氣孔減少水分的喪失，而在鹽脅迫下，接種SQR9分別降低了玉米和擬南芥內(nèi)ZmNCED和AtNCED3基因(ABA合成的關(guān)鍵基因)的轉(zhuǎn)錄水平，抑制了玉米和擬南芥中ABA含量的升高。接種SQR9將玉米和擬南芥TSS含量增加為對(duì)照的2.29倍和1.47倍。接種SQR9雖然顯著提高了玉米的過(guò)氧化物酶(POD)活性，但對(duì)擬南芥P

6、OD活性并沒(méi)有顯著的影響。接種SQR9的玉米的過(guò)氧化氫酶(CAT)活性是對(duì)照（添加等量失活SQR9菌液處理組）的1.75倍，接種SQR9的擬南芥的CAT活性增加到對(duì)照的2.19倍。接種SQR9的玉米內(nèi)GSH含量是對(duì)照組的2.43倍，接種SQR9的擬南芥內(nèi)GSH含量提高到對(duì)照組的2.49倍。在鹽脅迫下，接種SQR9的植物內(nèi)過(guò)氧化氫的含量顯著低于未接種SQR9的植物。通過(guò)分根實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下接種SQR9導(dǎo)致根系環(huán)境中Na+含量顯著高于未

7、接種對(duì)照，說(shuō)明SQR9能夠協(xié)助植物排除Na+或者減少Na+的攝入。同時(shí)接種SQR9分別增加了玉米和擬南芥中Na+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，如SQR9增加了玉米中ZmNHX1，ZmNHX2，ZmNHX3和ZmH+-PPase基因的轉(zhuǎn)錄水平和擬南芥中AtNHX1和AtNHX7基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而減少Na+對(duì)植物造成的傷害。
　　通過(guò)透析袋截留不同分子量的SQR9分泌物，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)植物耐鹽的SQR9信號(hào)物質(zhì)的大小在100 Da到500 Da

8、之間。通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)該范圍內(nèi)的分泌物所影響的植物耐鹽途徑，發(fā)現(xiàn)100～500 Da的SQR9分泌物主要通過(guò)提高玉米的GSH含量并減少Na+含量來(lái)促進(jìn)植物的鹽脅迫耐受性。而在擬南芥中，100～500 Da的SQR9信號(hào)物質(zhì)能夠增強(qiáng)CAT的活性、提高GSH含量并減少植物體內(nèi)Na+含量。并且，利用相關(guān)的擬南芥突變體進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)GSH合成相關(guān)基因(GS和GR)的敲除導(dǎo)致接種SQR9不能增強(qiáng)植物耐鹽能力，以及鹽過(guò)敏反應(yīng)(SOS)途徑關(guān)鍵基因(S

9、OS1，SOS2，SOS3和NHX1)的敲除也會(huì)導(dǎo)致接種SQR9不能增強(qiáng)植物耐鹽能力，該結(jié)果進(jìn)一步證明了GSH含量的增加以及對(duì)SOS途徑的調(diào)控是SQR9100～500Da的信號(hào)物質(zhì)協(xié)助植物耐受鹽脅迫的主要途徑。
　　在對(duì)SQR9分泌的誘導(dǎo)植物耐受鹽脅迫的信號(hào)物質(zhì)的進(jìn)一步研究中，我們發(fā)現(xiàn)SQR9產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)(VOCs)不能顯著增強(qiáng)鹽脅迫下擬南芥的生物量，說(shuō)明VOCs并非是SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的信號(hào)物質(zhì)?！鱵snE是SQR9的

10、突變體，突變菌株的吲哚乙酸(IAA)產(chǎn)量顯著降低了86％，通過(guò)用△ysnE接種鹽脅迫下的擬南芥，其相對(duì)應(yīng)的擬南芥鮮重和側(cè)根數(shù)目與接種野生型SQR9的擬南芥相比有所下降，但是與對(duì)照相比仍可以顯著增強(qiáng)鹽害下擬南芥的生物量，結(jié)果表明IAA并非是SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的主要信號(hào)物質(zhì)。通過(guò)用乙酸乙酯、乙醚、正戊烷、氯仿和水相萃取100～500Da的SQR9發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下，擬南芥莖葉的生物量在添加未經(jīng)過(guò)萃取的SQR9發(fā)酵液、水相SQR9發(fā)

11、酵液、乙醚萃取的SQR9發(fā)酵液和氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液的處理中相對(duì)于對(duì)照組分別提高了75.75％、34.68％、53.21％和95.43％。而只有未經(jīng)過(guò)萃取的SQR9發(fā)酵液、乙醚萃取的SQR9發(fā)酵液和氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液導(dǎo)致擬南芥根鮮重的顯著增加，增加幅度分別為35.75％、20.75％和70.9％，乙酸乙酯和正戊烷萃取的SQR9發(fā)酵液并沒(méi)有顯著增加擬南芥生物量。其中氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫效果最佳，因此推測(cè)SQR

12、9信號(hào)物質(zhì)應(yīng)極易被氯仿萃取。據(jù)報(bào)道，100～500 Da之間的潛在的促進(jìn)植物耐受鹽脅迫的物質(zhì)主要包括赤霉素、玉米素、海藻糖和多胺類，通過(guò)液相色譜(HPLC)檢測(cè)SQR9發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)SQR9不能產(chǎn)生精胺，只能產(chǎn)生亞精胺。此外通過(guò)檢測(cè)100～500 Da的潛在信號(hào)物質(zhì)在上述溶劑中的溶解度，發(fā)現(xiàn)只有亞精胺在氯仿中的溶解度較高，該結(jié)果顯示，SQR9所分泌的能夠誘導(dǎo)植物耐受鹽脅迫的信號(hào)物質(zhì)可能是亞精胺。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源亞精胺增強(qiáng)植物耐鹽的有效濃度范

13、圍是1～10μM，但是當(dāng)濃度大于500μM時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)有抑制甚至致死作用。我們?cè)赟QR9找到了完整的亞精胺合成途徑，并通過(guò)同源重組雙交換，敲除SQR9內(nèi)亞精胺合成關(guān)鍵基因speB，得到突變子△speB，并構(gòu)建了相應(yīng)的互補(bǔ)菌株c-△speB。通過(guò)HPLC對(duì)野生型SQR9、△speB、c-△speB菌株的亞精胺的產(chǎn)量進(jìn)行了分析，野生型SQR9和c-△speB胞外亞精胺的產(chǎn)量分別是26.40μM和22.20μM(OD600=1.0)，胞內(nèi)亞精

14、胺的產(chǎn)量是29.93和26.59μM(OD600=1.0)，而突變子幾乎不產(chǎn)亞精胺，突變子和互補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)曲線與野生型無(wú)顯著差異，說(shuō)明speB基因的敲除和互補(bǔ)載體的融入并沒(méi)有影響到細(xì)菌的生長(zhǎng)。接種突變子△speB不能增強(qiáng)植物的耐鹽能力，互補(bǔ)菌株c-△speB仍可以顯著增強(qiáng)植物耐鹽能力，說(shuō)明亞精胺是SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的重要信號(hào)物質(zhì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺能夠促進(jìn)植物GSH合成相關(guān)基因GS和GR的表達(dá)，并提高植物GSH含量，從而緩解植

15、物受到的氧化傷害;還能夠調(diào)控液泡上Ca2+通道蛋白基因TPC1的表達(dá)來(lái)改變細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量，從而激活SOS途徑，并提高液泡膜和細(xì)胞膜上的Na+通道蛋白基因NHX1和NHX7的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Na+的區(qū)域化，從而減少了植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+含量。
　　綜上所述，SQR9能夠通過(guò)影響植物多條途徑促進(jìn)植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力，主要通過(guò)合成亞精胺來(lái)促進(jìn)植物GSH的合成，從而緩解植物受到的氧化傷害;通過(guò)調(diào)控細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量來(lái)激活SOS途徑;以