β-欖香烯放療增敏作用與乏氧及其分子靶點(diǎn)篩選的相關(guān)性研究.pdf

1、β-欖香烯是從中藥中提取的抗腫瘤有效成分,其放療增敏作用已經(jīng)得到肯定,但其放射增敏機(jī)制尚未完全闡述清楚,仍有諸多未知領(lǐng)域值得深入探索。
　　 乏氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境普遍存在的現(xiàn)象,在乏氧狀態(tài)下諸多相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯,以使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)微環(huán)境的乏氧狀態(tài)。目前乏氧細(xì)胞中研究最深入的轉(zhuǎn)錄因子是HIF-1,由α和β兩個(gè)亞基組成,其中HIF-1α受氧的調(diào)節(jié),HIF-1β與氧調(diào)節(jié)無(wú)關(guān)。Survivin是接受HIF-1α調(diào)節(jié)的重要分子,乏氧條

2、件下HIF-1α可以直接連接到survivin的啟動(dòng)子,發(fā)揮正向調(diào)節(jié)survivin轉(zhuǎn)錄的作用。HIF-1α和survivin與腫瘤的放療抵抗性密切相關(guān),HIF-1α和survivin的高表達(dá)均預(yù)示患者放療效果差及局部復(fù)發(fā)、總生存期減少等不良后果。因此,目前認(rèn)為HIF-1α和survivin是增加腫瘤放療敏感性和提高放療療效的潛在分子靶點(diǎn)。PI3K/AKT/mTOR通路是調(diào)節(jié)HIF-1α的蛋白表達(dá)的主要通路之一,而且也與放療抵抗性密切相

3、關(guān)。另外,近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn),survivin的表達(dá)通過(guò)mTOR途徑調(diào)節(jié)。
　　 既往的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)β-欖香烯的放射增敏機(jī)制主要集中在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、促使腫瘤細(xì)胞G-M期阻滯等方面,而survivin恰是在細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。HIF-1α是survivin轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)解者,而HIF-1α與腫瘤的乏氧狀態(tài)密切相關(guān)。β-欖香烯是否直接作用于HIF-1α-survivin這條通路,或者作用于HIF-1α

4、上游的PI3K通路來(lái)調(diào)節(jié)HIF-1α的蛋白表達(dá),進(jìn)而改善腫瘤的乏氧狀態(tài),減少放療抵抗性,達(dá)到放射增敏的目的,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有報(bào)道。β-欖香烯是作用于多靶點(diǎn)的新藥,通過(guò)高通量的蛋白組學(xué)技術(shù)尋找β-欖香烯放射增敏的新靶點(diǎn)是切實(shí)可行的科學(xué)方法,對(duì)于闡明β-欖香烯的放射增敏機(jī)制具有重要的意義。
　　 目的:
　　 1.構(gòu)建人肺腺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型;通過(guò)整體實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量β-欖香烯對(duì)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用,確定適宜的增敏

5、劑量;研究增敏劑量的β-欖香烯與放療聯(lián)合對(duì)于內(nèi)源性乏氧標(biāo)記物CAIX、外源性乏氧標(biāo)記物-乏氧探針(Pimonidazole Hydrochloride)的作用。
　　 2.β-欖香烯放療增敏作用與乏氧關(guān)鍵分子HIF-1α及其下游的survivin以及細(xì)胞凋亡的相關(guān)性以及與HIF-1α上游的P13K/mTOR通路的相關(guān)性研究,尋找β-欖香烯放療增敏作用的新靶點(diǎn)。
　　 3.應(yīng)用熒光雙向差異凝膠電泳(2D DIGE)蛋白質(zhì)組

6、學(xué)技術(shù),對(duì)放療組和聯(lián)合組的移植瘤進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的篩選,發(fā)現(xiàn)β-欖香烯放療增敏作用的新靶點(diǎn);應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法進(jìn)行新靶點(diǎn)的驗(yàn)證。
　　 方法:
　　 第一部分
　　 1.采用細(xì)胞懸液接種法建立裸鼠移植瘤模型;將達(dá)到0.8～1.0cm3瘤體積的裸鼠隨機(jī)分組(每組5只):對(duì)照組(NaCl)、25mg/kg藥物組、45mg/kg藥物組、100mg/kg藥物組、放療組(NaCl+放療)、25mg

7、/kg藥物+放療組、45mg/kg藥物+放療組、100mg/kg藥物+放療組。腹腔注射β-欖香烯,對(duì)照組注射同等體積生理鹽水。與放療聯(lián)合時(shí),β-欖香烯于放療前1h腹腔注射。采用6MeV電子線照射,劑量為5Gy。
　　 2.治療后移植瘤體積倍增時(shí)觀測(cè)結(jié)束,獲得各組的生長(zhǎng)曲線。計(jì)算各組的平均抑瘤率并對(duì)各組體積變化進(jìn)行比較。根據(jù)不同的體積倍增時(shí)間,計(jì)算各組的增敏系數(shù)(EF),確定實(shí)驗(yàn)采用的增敏劑量。
　　 3.采用增敏劑量的β

8、-欖香烯,將瘤體積達(dá)到0.8～1.0cm3的新裸鼠再次給予隨機(jī)分組,每組5只,即:對(duì)照組(NaCl)、藥物組(增敏劑量)、放療組、藥物(增敏劑量)+放療組。24h后斷頸法處死裸鼠,獲得移植瘤組織。
　　 4.應(yīng)用免疫組化染色檢測(cè)各組移植瘤CAIX及乏氧探針的表達(dá)。
　　 第二部分
　　 1.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組移植瘤HIF-1α、survivin、P13K及mTOR的mRNA表達(dá)。
　　 2.West

9、ern blot技術(shù)檢測(cè)各組移植瘤HIF-1α、survivin的蛋白表達(dá)。
　　 3.免疫組化方法檢測(cè)各組移植瘤HIF-1α、survivin表達(dá)。
　　 4.TUNEL方法檢測(cè)各組移植瘤的細(xì)胞凋亡情況。
　　 第三部分
　　 1.采用2D DIGE蛋白組學(xué)技術(shù),篩選放療組、聯(lián)合組的差異蛋白質(zhì)。
　　 2.采用RT-PCR和Western blot方法,對(duì)于差異蛋白質(zhì)peroxiredoxin-

10、1(Prx-1)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分
　　 1.成功建立裸鼠移植瘤模型,根據(jù)體積變化獲得各組的生長(zhǎng)曲線。在2～8d之間,25、45和100mg/kg組的平均抑瘤率隨劑量的增加而增加,說(shuō)明β-欖香烯的損腫瘤作用具有劑量依賴性。
　　 2.各劑量組的EF值分別為0.84(25mg/kg)、1.24(45mg/kg)、2.04(100mg/kg),說(shuō)明45mg/kg和100mg/kgβ-欖香

11、烯具有放療增敏作用。但是100mg/kg直接抑制腫瘤作用過(guò)強(qiáng),超過(guò)了單純放療組,而45mg/kg抑制腫瘤作用中等,因此下步實(shí)驗(yàn)研究采用45mg/kg作為放射增敏劑量。
　　 2.各組CAIX表達(dá)情況:藥物組與對(duì)照組比較表達(dá)增強(qiáng)(p＜0.05),放療組與對(duì)照組比較表達(dá)略增強(qiáng)(p＞0.05),聯(lián)合組與其它各組比較表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。
　　 3.各組乏氧探針表達(dá)情況:藥物組與對(duì)照組比較差異不大(p＞0.05),放療組

12、與其它各組比較表達(dá)明顯增強(qiáng)(p＜0.05),聯(lián)合組與其它各組比較表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。
　　 第二部分
　　 1.各組HIF-1α和survivin表達(dá):藥物組與對(duì)照組比較,二者的mRNA表達(dá)均增高(HIF-1α:p＜0.01;survivin:p＜0.05);藥物組與對(duì)照組比較,二者的蛋白表達(dá)下降(p＜0.05)。放療組與對(duì)照組比較,兩者的mRNA和蛋白表達(dá)均增高(p＜0.01)。聯(lián)合組與其余各組比較,明顯抑制

13、二者的mRNA和蛋白的表達(dá)(p＜0.01)。免疫組化表達(dá)結(jié)果:藥物組與對(duì)照組比較,二者的表達(dá)差異不大(p＞0.05)。放療組與對(duì)照組比較,明顯增高二者的表達(dá)(HIF-1α:p＜0.05;survivin:p＜0.01)。聯(lián)合組與其余各組比較明顯抑制二者的表達(dá)(p＜0.01)。
　　 2.TUNEL檢測(cè)結(jié)果:藥物組和放療組與對(duì)照組比較,凋亡細(xì)胞比例明顯增高(p＜0.05)。聯(lián)合組與其它各組比較,細(xì)胞凋亡比例明顯增高(p＜0.01)

14、。3.各組PI3K和mTOR的mRNA表達(dá):藥物組與對(duì)照組比較,PI3KmRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異(p＞0.05);放療組與對(duì)照組比較,PI3KmRNA表達(dá)明顯增高(p＜0.01);聯(lián)合組與放療組比較PI3KmRNA表達(dá)水平差異不大(p＞0.05)。藥物組和放療組與對(duì)照組比較,mTORmRNA表達(dá)明顯下降(p＜0.01);聯(lián)合組mTORmRNA表達(dá)基本檢測(cè)不出。
　　 第三部分
　　 1.DIGE圖像經(jīng)軟件分析,發(fā)現(xiàn)17

15、個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量顯著改變,其中聯(lián)合組與放療組比較有8個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下降,其它9個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上升。
　　 2.表達(dá)差異的蛋白質(zhì)通過(guò)質(zhì)譜分析,并數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,發(fā)現(xiàn)與放療具有相關(guān)性的第780號(hào)蛋白質(zhì):peroxiredoxin-1(Prx-1)。
　　 3.各組Prx-1mRNA的表達(dá)情況:藥物組與對(duì)照組比較,Prx-1mRNA表達(dá)明顯下降(p＜0.01)。放療組與對(duì)照組比較,Prx-1mRNA表達(dá)明顯提高(p＜0.01)。聯(lián)合

16、組與其余各組比較,Prx-1mRNA表達(dá)明顯下降(p＜0.01)。
　　 4.各組Prx-1蛋白的表達(dá)情況:藥物組與對(duì)照組比較,Prx-1蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化(p＞0.05)。放療組與對(duì)照組比較,Prx-1蛋白表達(dá)明顯提高(p＜0.01)。聯(lián)合組與其余各組比較,Prx-1蛋白表達(dá)明顯下降(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 第一部分:
　　 1.成功建立肺癌A549細(xì)胞株的裸鼠移植瘤模型;通過(guò)觀察腫瘤體

17、積退縮程度及生長(zhǎng)的延遲,發(fā)現(xiàn)β-欖香烯的直接抗腫瘤作用具有劑量依賴性。
　　 2.根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組的體積倍增時(shí)間,依據(jù)公式計(jì)算不同劑量水平的EF值,確定45mg/kg為適宜的增敏劑量。
　　 3.增敏劑量的β-欖香烯促進(jìn)移植瘤組織內(nèi)源性CAIX的表達(dá),對(duì)于外源性的乏氧探針表達(dá)影響不大,說(shuō)明增敏劑量的β-欖香烯單獨(dú)應(yīng)用并不改善腫瘤組織的乏氧狀態(tài)。
　　 4.單純放療促進(jìn)CAIX與乏氧探針的表達(dá),說(shuō)明單次放療后24小時(shí),

18、腫瘤的乏氧狀態(tài)加重,促進(jìn)了腫瘤的放療抵抗性。
　　 5.β-欖香烯與放療聯(lián)合應(yīng)用明顯抑制內(nèi)、外源性乏氧標(biāo)記物的表達(dá),提示二者聯(lián)合可能通過(guò)改善腫瘤組織乏氧狀態(tài),達(dá)到放療增敏的作用。
　　 第二部分:
　　 1.增敏劑量的β-欖香烯與放療聯(lián)合明顯抑制移植瘤中HIF-1α和survivin的mRNA和蛋白水平的表達(dá),提示HIF-1α和survivin是β-欖香烯放療增敏作用的新靶點(diǎn)。
　　 2.增敏劑量的β-欖

19、香烯與放療聯(lián)合明顯增加移植瘤組織的細(xì)胞凋亡,提示β-欖香烯通過(guò)抑制HIF-1α-survivin通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　 3.增敏劑量的β-欖香烯對(duì)于移植瘤中PI3KmRNA表達(dá)沒(méi)有作用,對(duì)于mTOR的mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用,與放療聯(lián)合顯著抑制mTOR mRNA表達(dá),提示mTOR可能是β-欖香烯增敏作用的潛在靶點(diǎn)。
　　 4.單純放療誘導(dǎo)HIF-1α和survivin的mRNA和蛋白表達(dá),但是對(duì)于mTORmR

20、NA表達(dá)明顯抑制,提示放療誘導(dǎo)HIF-1α和survivinm表達(dá)增高的機(jī)制主要由于放療導(dǎo)致ROS的增高,引起的腫瘤的防御反應(yīng)所致,而不是依賴mTOR途徑調(diào)控。
　　 第三部分:
　　 1.應(yīng)用2D DIGE蛋白組學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)放療組和聯(lián)合組之間有17個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量顯著改變,其中聯(lián)合組與放療組比較有8個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下降,其它9個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上升。通過(guò)質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,發(fā)現(xiàn)差異蛋白:peroxiredoxin-1(Prx