新型鳥(niǎo)嘌呤四鏈體合成方法及其在分析傳感中的研究.pdf

1、DNA是主要遺傳信息的載體和調(diào)控者。隨著多學(xué)科的交叉發(fā)展，DNA分子不僅僅是具有信息儲(chǔ)存功能的載體，DNA的其他功能的也被發(fā)現(xiàn)。通過(guò)特定的篩選過(guò)程，人們可以得到一些具有特殊功能的核酸分子，這類核酸稱為功能核酸。功能核酸主要可以分為兩大類:一類是類似于抗原抗體具有識(shí)別功能的核酸分子，能結(jié)合特定的目標(biāo)物，這類DNA或者RNA稱為核酸適配體(Aptamer);另一類是類似于某些酶，可以催化一些反應(yīng)的發(fā)生，這類DNA或者RNA稱為核酶(DNAz

2、yme/RNAzyme)。功能核酸的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了人們對(duì)于核酸的認(rèn)識(shí)，也為科研工作者提供了新型的分子工具。功能核酸的本質(zhì)是DNA或者RNA，相比于蛋白質(zhì)本質(zhì)的抗體或者酶，合成方法可控，操作簡(jiǎn)單，并且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易失活，沒(méi)有不同生產(chǎn)批次活性不同的影響。近年來(lái)，多種基于功能核酸的分析方法被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于各種生化分析，因其良好的生物相容性和可以識(shí)別并結(jié)合特定分子的性質(zhì)，也被應(yīng)用于生物成像和癌癥的治療。
　　功能核酸在行使其功能時(shí)，都會(huì)形成特

3、定的二級(jí)或者三級(jí)結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)某種目標(biāo)物的結(jié)合或者催化活性區(qū)域的產(chǎn)生。具有過(guò)氧化物酶活性的DNAzyme是分析化學(xué)中常用的功能核酸分子之一，這種DNAzyme是由鳥(niǎo)嘌呤四鏈體及hemin構(gòu)成，因其可以催化底物產(chǎn)生顏色變化而廣泛應(yīng)用于各種目標(biāo)物的分析。當(dāng)前這種DNAzyme的研究多集中于已知固定序列的鳥(niǎo)嘌呤四鏈體，隨機(jī)序列研究很少，我們主要研究了隨機(jī)排列富含鳥(niǎo)嘌呤序列的合成新方法和相關(guān)應(yīng)用。
　　具體內(nèi)容如下:
　　1.隨機(jī)排列

4、鳥(niǎo)嘌呤四鏈體的合成新方法
　　本章利用一種無(wú)需模板的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal DeoxynucleotidylTransferase，TdT)，來(lái)獲得隨機(jī)排列的富含鳥(niǎo)嘌呤的長(zhǎng)鏈DNA。對(duì)獲取的長(zhǎng)鏈DNA的性質(zhì)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)這種富含鳥(niǎo)嘌呤的隨機(jī)排列的DNA與hemin結(jié)合后，與一般固定序列的DNAzyme有類似的催化活性。選取三種比例的底物組成，分別考察TdT延伸的產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度，結(jié)構(gòu)，和DNAzyme活性。其中當(dāng)d

5、GTP∶dATP=6∶4時(shí)，所獲得的TdT延伸產(chǎn)物與hemin形成復(fù)合物具有的DNAzyme活性最高。并且，這種隨機(jī)排列富含鳥(niǎo)嘌呤的DNA可以與特異性結(jié)合鳥(niǎo)嘌呤四鏈體的熒光染料硫磺素T(Thioflavine T，ThT)結(jié)合，結(jié)合后大大增強(qiáng)ThT的熒光。我們證明了這種隨機(jī)排列的富含鳥(niǎo)嘌呤的DNA可以形成鳥(niǎo)嘌呤四鏈體結(jié)構(gòu)，并且具有高效的DNAzyme活性和特異性結(jié)合熒光染料的性質(zhì)，擴(kuò)大了對(duì)于鳥(niǎo)嘌呤四鏈體的認(rèn)識(shí)，提供了產(chǎn)生鳥(niǎo)嘌呤四鏈體的新

6、方法。
　　2.隨機(jī)排列鳥(niǎo)嘌呤四鏈體在生物分析中的應(yīng)用
　　基于上一章對(duì)于TdT生成的鳥(niǎo)嘌呤四鏈體的研究，我們開(kāi)發(fā)了一些基于隨機(jī)排列的鳥(niǎo)嘌呤四鏈體在生物分析中的應(yīng)用，主要分析對(duì)象有目標(biāo)DNA，蛋白質(zhì)，和酶。相比于傳統(tǒng)的基于DNAzyme作為信號(hào)輸出的方法，基于TdT方法生成的鳥(niǎo)嘌呤四鏈體不需要在體系中引入含有DNAzyme的序列，避免預(yù)先存在的DNAzyme帶來(lái)的背景信號(hào)。首先，我們開(kāi)發(fā)了一種無(wú)標(biāo)記檢測(cè)TdT酶活性的方法，因

7、為背景信號(hào)低，TdT聚合產(chǎn)生的DNA形成的DNAzyme具有較高活性，此方法具有很高的信背比，為實(shí)現(xiàn)低濃度無(wú)標(biāo)記檢測(cè)TdT提供了有效方法，檢測(cè)限可以達(dá)到0.0394U(S/N=3)。其次，由于TdT產(chǎn)生的隨機(jī)排列的鳥(niǎo)嘌呤四鏈體結(jié)合染料ThT的速度非?？欤雰?nèi)可以達(dá)到平衡，利用這個(gè)性質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)TdT的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，這也是對(duì)TdT實(shí)時(shí)檢測(cè)的首次報(bào)道。該方法也可以應(yīng)用于實(shí)際樣品中的TdT檢測(cè)，我們?cè)?0％的人血清中進(jìn)行了測(cè)試，證明此方法有潛力應(yīng)

8、用于臨床診斷。目標(biāo)DNA的檢測(cè)，是通過(guò)內(nèi)切酶輔助的信號(hào)放大方法(NESA)與TdT產(chǎn)生的DNAzyme聯(lián)用。先將信號(hào)探針3'端用磷酸基團(tuán)封閉，當(dāng)有目標(biāo)DNA存在時(shí)，內(nèi)切酶識(shí)別信號(hào)探針與目標(biāo)DNA形成的雙鏈結(jié)構(gòu)對(duì)信號(hào)探針進(jìn)行切割，釋放出含有3'-OH的小片段作為T(mén)dT延伸引物，目標(biāo)DNA從雙鏈結(jié)構(gòu)上脫落進(jìn)入下一輪循環(huán)。目標(biāo)蛋白質(zhì)（凝血酶）的檢測(cè)，是通過(guò)構(gòu)建含有識(shí)別凝血酶核酸適配體序列和限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列形成的封閉發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當(dāng)有凝血酶存在

9、時(shí)，由于核酸適配體的識(shí)別作用打開(kāi)發(fā)夾，釋放出與信號(hào)探針互補(bǔ)的區(qū)域，引起NESA過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。生化分析中的常見(jiàn)目標(biāo)DNA，蛋白質(zhì)和酶的成功檢測(cè)，表明TdT產(chǎn)生的隨機(jī)排列富含鳥(niǎo)嘌呤四鏈體在生物分析中有普遍的適用性。
　　3.隨機(jī)排列鳥(niǎo)嘌呤四鏈體用于凋亡細(xì)胞的檢測(cè)
　　基于前面章節(jié)TdT可以在最優(yōu)比例dNTP條件下聚合產(chǎn)生可以形成鳥(niǎo)嘌呤四鏈體DNA的方法，我們開(kāi)發(fā)了一種基于隨機(jī)排列鳥(niǎo)嘌呤四鏈體用于凋亡細(xì)胞檢測(cè)的方法

10、。凋亡過(guò)程中細(xì)胞的基因組DNA會(huì)斷裂成180-200 bp的小片段，通過(guò)對(duì)這些含有缺口的小片段DNA檢測(cè)可以反映細(xì)胞的凋亡情況?；陔S機(jī)排列鳥(niǎo)嘌呤四鏈體的方法可以實(shí)現(xiàn)原位免標(biāo)記檢測(cè)凋亡細(xì)胞。首先，我們基于隨機(jī)排列鳥(niǎo)嘌呤四鏈體實(shí)現(xiàn)低濃度單鏈DNA的檢測(cè)。然后對(duì)質(zhì)粒DNA和Hela細(xì)胞的基因組DNA，利用DNaseⅠ酶切處理，再用TdT延伸的方法實(shí)現(xiàn)了大分子DNA的檢測(cè)?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，我們開(kāi)發(fā)了一種基于TdT產(chǎn)生鳥(niǎo)嘌呤四鏈體原位檢測(cè)凋亡

11、細(xì)胞的方法。并且，此方法與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀定量法和凝膠電泳法取得了一致的結(jié)果。
　　4.超電荷綠色熒光蛋白與G4/hemin復(fù)合物的相互作用的研究與應(yīng)用
　　我們首次發(fā)現(xiàn)G4/hemin復(fù)合物可以淬滅超電荷綠色熒光蛋白的熒光，而單獨(dú)的hemin或者h(yuǎn)emin與非G4結(jié)構(gòu)的DNA不能淬滅超電荷綠色蛋白的熒光。為了進(jìn)一步理解淬滅過(guò)程，我們開(kāi)展了一系列的實(shí)驗(yàn)來(lái)探討其淬滅機(jī)理。通過(guò)對(duì)熒光蛋白的發(fā)射光譜與G4/hemin復(fù)合物吸收光譜