納豆激酶在保加利亞乳桿菌中食品級(jí)表達(dá)及分析.pdf

1、目前，心血管疾病已成為人類健康的最大威脅之一，關(guān)于血栓病的治療和新型溶血栓類藥物的開發(fā)與應(yīng)用的研究成為近幾年熱點(diǎn)。納豆激酶作為功能性食品和食品添加劑等的發(fā)展已十分迅速，其降血壓、降血脂、抗血栓、抗病毒、抗氧化、預(yù)防癌癥等多種生理調(diào)節(jié)功能使其為新一代具有開發(fā)潛力的食源性溶栓藥物。但由于納豆激酶主要來源于日本納豆，因口味獨(dú)特而不被大眾接受，所以在食品方面開發(fā)較少，因此，將納豆激酶作為功能性食品開發(fā)迫在眉睫。而乳酸菌作為安全的食品級(jí)微生物已逐

2、漸成為當(dāng)今世界食品業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。伴隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，研究者對(duì)其研究并不僅限于對(duì)其傳統(tǒng)生理功能的開發(fā)，而逐步深入到乳酸菌基因水平的研究。人們利用DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建適用于乳酸菌的表達(dá)載體，使乳酸菌能夠成功表達(dá)外源基因，從而具備新的益生性能。
　　本文通過將載體pMGthyA-ppNK電轉(zhuǎn)保加利亞乳桿菌thyA缺陷型菌株，實(shí)現(xiàn)納豆激酶在乳酸菌中食品級(jí)表達(dá)。通過測(cè)定質(zhì)粒穩(wěn)定性，證明該載體在保加利亞乳桿菌中連續(xù)傳

3、代15代仍可以穩(wěn)定存在，結(jié)合平板劃線進(jìn)行傳代時(shí)可連續(xù)傳代30代穩(wěn)定。利用半定量RT-PCR的方法，從基因水平驗(yàn)證了保加利亞乳桿菌異源表達(dá)納豆激酶。由SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠分析納豆激酶的分子量約為28 KD。通過測(cè)定保加利亞乳桿菌異源表達(dá)食品級(jí)納豆激酶的酶學(xué)性質(zhì)，證明納豆激酶的最適溫度為40℃，在低于40℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好，最適pH為7.0，pH在6.0-8.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。Ca2+、Mn2+、Fe2+促進(jìn)酶活的活性隨著濃度的變化而

4、不同，Cu2+、Hg2+對(duì)該酶起到明顯的抑制作用，Ag+隨濃度的增加抑制效果逐漸顯著，而蛋白抑制劑PSMF對(duì)納豆激酶具有明顯抑制作用，說明納豆激酶為絲氨酸蛋白酶。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間18h，接種量2％，接種齡為16h，酶活達(dá)到3.498 U/mL，是未優(yōu)化前酶活的1.16倍。
　　由于本實(shí)驗(yàn)證明納豆激酶在模擬人工胃液中幾乎沒有酶活，胃蛋白酶對(duì)納豆激酶的影響是不可逆的，但納豆

5、激酶可以在腸液中穩(wěn)定存在而并不被胰蛋白酶所降解，在腸液4h時(shí)相對(duì)酶活可達(dá)到60％左右。因此，本研究將納豆激酶轉(zhuǎn)化至保加利亞乳桿菌中，利用乳酸菌攜帶納豆激酶順利通過胃液到達(dá)腸道，結(jié)果證明該酶到達(dá)腸道保留了一定酶活，并在腸道達(dá)到3h時(shí)酶活到達(dá)最高，由于菌體的解體，胞外酶活為32％左右。微量金屬離子可以促進(jìn)菌體自溶從而提高納豆激酶的釋放，實(shí)驗(yàn)證明Ca2+和Mg2+在濃度為10-4 mol/L時(shí)，自溶度最大分別達(dá)到25％和24％左右，相對(duì)酶活達(dá)

6、到129％和123％左右;Mn2+在濃度為10-5 mol/L時(shí)自溶度最大，可到達(dá)20％左右，相對(duì)酶活達(dá)到114％左右，和空白對(duì)照相比較均有所提高。并且通過體外溶栓實(shí)驗(yàn)證明保加利亞乳桿菌異源表達(dá)食品級(jí)納豆激酶具有明顯的溶栓活性，并利用滅活纖溶酶原的方法表明該酶溶解纖維蛋白的作用不同于尿激酶的間接纖溶作用，而是直接作用于纖維蛋白。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為食品級(jí)表達(dá)載體在乳酸菌中異源表達(dá)提供了可參考的依據(jù)，同時(shí)為乳酸菌食品級(jí)表達(dá)納豆激酶在應(yīng)