植物ICKs在大孢子發(fā)生和雌配子體形成過程中的功能分析.pdf

1、ICKs/KRPs(Inhibitors of cyclin-dependent kinase/Kip-related proteins，以下簡(jiǎn)稱ICKs)是植物細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent Kinase，CDK)的抑制因子，能抑制細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞分裂進(jìn)而在細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要作用。擬南芥基因組中有7個(gè)ICK基因，由于成員之間功能上的冗余性，目前對(duì)植物中ICK基因家族的功能以及各成員之間的功能特異性還缺乏

2、深入了解。本實(shí)驗(yàn)室先前對(duì)ICK1/2/5/6/7的T-DNA插入五突變體進(jìn)行了研究。本研究旨在創(chuàng)建ICK T-DNA插入六突變體和七突變體的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究ICK基因家族所有成員的敲除對(duì)植物生長發(fā)育的影響。
　　對(duì)一個(gè)擬南芥六突變體ick123567和七突變體（所有ICK基因被敲除）表型分析顯示，與五突變體ick12567和野生型相比，七突變體的植物幼苗鮮重和粒重顯著增加。多種非生物脅迫處理，包括植物生長素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、氯

3、化鈉、蔗糖、paraquat和S-甲基甲烷硫代磺酸，野生型和七突變體的根長及生長量之間的差異不顯著。
　　ICK七突變體角果變短、每個(gè)角果種子數(shù)減少。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，七突變體中有47％的胚珠敗育，而五突變體ick12567、六突變體ick123567和野生型中胚珠正常。正反交結(jié)果顯示七突變體作為母本時(shí)才能觀察到短角果的表型，說明這個(gè)表型是由于雌配子體發(fā)育缺陷造成的。對(duì)處于雌配子體發(fā)育第7時(shí)期(FG7)的胚囊發(fā)育觀察表明，野生型胚囊

4、在授粉之前三個(gè)反足細(xì)胞降解;而七突變體胚囊中除了正常的配子外，還有額外的細(xì)胞核，這些細(xì)胞核可以被區(qū)分為是具有一個(gè)卵細(xì)胞、一個(gè)中央細(xì)胞和兩個(gè)助細(xì)胞的兩套、三套或者四套的配子體，不同配子體間有時(shí)可見清楚的界限，表明突變體胚珠中有多個(gè)獨(dú)立的胚囊存在。利用卵細(xì)胞標(biāo)記pEC1.1::GUS和中央細(xì)胞標(biāo)記pFIS2::GUS確定了七突變體胚珠中多個(gè)卵細(xì)胞和中央細(xì)胞的存在。
　　功能大孢子時(shí)期，野生型胚珠只觀察到一個(gè)功能大孢子。七突變體中，有3

5、0％的胚珠觀察不到功能大孢子，而其余70％胚珠中可觀察到1-3個(gè)功能大孢子，極少胚珠中有4個(gè)。在FG2時(shí)期，野生型胚囊中有一對(duì)典型的細(xì)胞核，七突變體中有1-4對(duì)細(xì)胞核，每對(duì)細(xì)胞核之間界限分明。但在2-Ⅰ階段的胚珠中，野生型和七突變體中均只有一個(gè)大孢子母細(xì)胞。這些結(jié)果說明，七個(gè)ICK基因的敲除導(dǎo)致多個(gè)功能大孢子的形成并且能繼續(xù)發(fā)育成多套雌配子體。
　　開花后三天，野生型胚珠有一個(gè)胚和形態(tài)一致且分布在整個(gè)胚囊中的胚乳細(xì)胞核，而在七突變

6、體胚珠中觀察到胚乳中有不同類型的細(xì)胞核，或兩個(gè)或三個(gè)獨(dú)立的胚乳囊室，并且有雙胚的存在。在攜帶pEC1.1::GUS標(biāo)記的七突變體開花后三天的胚珠中，除了胚能觀察到GUS染色外，在合點(diǎn)端有1-2個(gè)不同的點(diǎn)也可觀察到GUS染色，說明受精后三天胚珠中沒有受精的額外卵細(xì)胞依然存活在胚囊中。與雙胚發(fā)育一致，七突變體中有2％的種子可以觀察到雙胚苗。經(jīng)野生型和攜帶有中央細(xì)胞標(biāo)記(pFIS2::GUS)的七突變體混合花粉授粉的七突變體，其后代中雙胚苗的