硫化氫及相關(guān)酶活性的雙光子熒光探針設(shè)計(jì)與成像分析.pdf

1、硫化氫(H2S)作為一種重要的氣體遞質(zhì)分子，在生命活動(dòng)中扮演著無可取代的角色。生物體內(nèi)的H2S主要由胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化底物L(fēng)-半胱氨酸產(chǎn)生，當(dāng)CBS/CSE的活性發(fā)生改變，會(huì)嚴(yán)重影響H2S的生理濃度，進(jìn)而誘發(fā)各類疾病。因此，精確掌握H2S的含量變化以及引起H2S濃度改變的生理機(jī)制顯得愈發(fā)重要。這不僅要求研究者準(zhǔn)確追蹤H2S生理濃度的變化，而且對(duì)引起H2S濃度改變的CBS/CSE活性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，

2、成為了科學(xué)工作者亟需解決的科學(xué)難題。
　　化學(xué)工作者近年來發(fā)展了一大批熒光分子探針用于監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)H2S的濃度變化，但大多數(shù)H2S探針是基于單光子檢測(cè)手段，對(duì)復(fù)雜生物體內(nèi)H2S的研究還存在一些困難。雖然一些已報(bào)道的H2S雙光子探針能夠很好地應(yīng)用于生物體內(nèi)的成像分析，但是大部分H2S探針的響應(yīng)時(shí)間需要30 min以上，不利于體內(nèi)快速代謝的H2S的檢測(cè)。另外，由于H2S的濃度與CBS/CSE的活性具有明顯的相關(guān)性，發(fā)展檢測(cè)CBS/CS

3、E的活性探針對(duì)進(jìn)一步了解H2S的生理機(jī)制具有重要的價(jià)值。但是，目前檢測(cè)CBS/CSE的方法主要集中在同位素標(biāo)記法、比色法以及分光光度法，但是，這些方法存在一些固有缺陷，比如操作繁瑣、程序復(fù)雜以及靈敏度低等，而且僅適用于體外檢測(cè)，無法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、無損、原位分析。因此，尋找一種能實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體內(nèi)CBS/CSE活性實(shí)時(shí)、無損檢測(cè)的手段是非常重要的。
　　針對(duì)H2S的研究現(xiàn)狀，且基于雙光子熒光成像具有分辨率高、組織穿透性好等優(yōu)勢(shì)，本文具體開展

4、了以下兩個(gè)工作:
　　(1)基于香豆素衍生物較強(qiáng)的雙光子吸收面積，本工作發(fā)展了一種新型的雙光子熒光探針TPP-H2S。為了提高TPP-H2S與H2S的反應(yīng)速率，引入了NBD-C1基團(tuán)。NBD-C1具有很強(qiáng)的拉電子效應(yīng)，使得連接基團(tuán)O帶部分正電荷，這為H2S的進(jìn)攻，提供了一個(gè)良好的親核位點(diǎn)。利用H2S較強(qiáng)的親核能力，TPP-H2S與H2S能夠快速地發(fā)生親核取代反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)過程僅需2 min左右。此外，NBD-C1與香豆素存在較好的

5、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，TPP-H2S的熒光被淬滅，當(dāng)醚鍵被H2S切斷，羥基被釋放出來，香豆素的熒光得以恢復(fù)。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，TPP-H2S具有很好的細(xì)胞穿透能力以及被成功的應(yīng)用于細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)快速代謝的H2S的監(jiān)測(cè)，而且通過活體解剖術(shù)，TPP-H2S首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠不同組織內(nèi)源性H2S含量的分析。
　　(2)基于氯代香豆素-部花青染料，本工作設(shè)計(jì)了一種新型的、能夠同時(shí)響應(yīng)H2S和Cys的雙光子熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)CBS/CSE活性的成

6、像分析。為了區(qū)分H2S和Cys的熒光發(fā)射光譜，結(jié)合H2S與Cys的分子特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了氯代香豆素和雙鍵兩個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。探針與H2S和Cys反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)第一階段，前者形成巰基香豆素-部花青，后者因親核基團(tuán)-NH2的存在，在親核取代過程中發(fā)生分子內(nèi)重排反應(yīng)形成氨基香豆素-部花青。隨后，兩者中間產(chǎn)物發(fā)生巰基與雙鍵的分子內(nèi)成環(huán)反應(yīng)，前者形成六元環(huán)，后者則形成七元環(huán)，造成產(chǎn)物的π電子結(jié)構(gòu)不同，兩者的熒光發(fā)射光譜區(qū)分開。由于生物體內(nèi)Cys在CBS/CSE

7、的催化作用下可以轉(zhuǎn)化為H2S，因此可以通過檢測(cè)H2S和Cys濃度的改變，表現(xiàn)為雙光子熒光信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)CBS/CSE活性的成像分析。
　　通過以上兩個(gè)工作，本文初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2S濃度的快速檢測(cè)以及不同小鼠組織內(nèi)的含量分析，更重要的是，實(shí)現(xiàn)了對(duì)能夠改變H2S生理濃度的CBS/CSE活性的成像分析?；诖?，本研究期望在人類對(duì)H2S生理濃度的檢測(cè)及引起H2S濃度改變的深層生理機(jī)制提供潛在價(jià)值，為全方位掌控H2S的動(dòng)態(tài)變