DCs靶向溫敏性siRNA納米載體的體外評價.pdf

1、目的：利用siRNA干擾技術抑制樹突狀細胞中凋亡基因Bak的表達，在細胞水平上進行了siRNA抑制效果的評估。但是，siRNA的給藥系統(tǒng)方面尚存不足，如靶向性低，轉染率低和體內(nèi)不穩(wěn)定等因素。所以，設計有效負載靶向DCs中Bak基因的siRNA藥物載體系統(tǒng)，對提高DCs的抗原提呈能力、促進免疫應答和增強抗腫瘤作用均具有非常積極的意義。本文基于DCs表面特異性表達的DEC-205受體，制備了負載siRNA的DEC-205抗體修飾的溫度敏感性

2、納米膠束，并對其制劑學特征、細胞毒性、靶向性、攝取率、攝取機制、siRNA的內(nèi)涵體逃逸及沉默效率和DCs存活率等方面進行評價，為構筑安全有效的抗腫瘤siRNA疫苗載體系統(tǒng)提供理論依據(jù)。
　　方法：首先，在前期研究的基礎上，合成并表征了 DEC-205修飾的溫度敏感性泊洛沙姆接枝殼聚糖聚合物（DEC-205-Po-CS），并對該聚合物納米膠束的粒徑、Zeta電位、包封率、溫敏性、穩(wěn)定性和細胞毒性進行了評價。其次，體外分離小鼠骨髓中單

3、個核細胞，利用細胞因子誘導分化獲得DCs，以Lipofectamine2000作為對照，通過流式細胞儀考察了DCs對負載FAM-siRNA的DEC-205-Po-CS納米膠束的攝取率。原子力顯微鏡觀察 DCs對納米膠束的內(nèi)吞作用，利用內(nèi)吞抑制劑進一步闡釋內(nèi)吞的具體路徑，熒光顯微鏡觀察冷休克對細胞內(nèi)涵體形態(tài)的影響。最后，利用Western Blot和 RT-PCR評價了 Bak基因沉默效率，并采用凋亡試劑盒測定了轉染負載沉默 Bak的si

4、RNA納米膠束后DCs的存活率。
　　結果：紅外光譜、核磁共振圖譜及熱重分析結果證實了泊洛沙姆接枝殼聚糖聚合物的合成，其 CMC值為（1.20±0.10）×10-6 mol·L-1。制備的載藥納米膠束粒徑為（230.9±3.9）nm，Zeta-電位為+（14.57±1.12）mV，包封率為（85.6±2.37）%，重現(xiàn)性均良好。流式細胞儀檢測表明DEC-205修飾納米膠束可提高DCs的攝取率。原子力顯微鏡觀察 DCs通過內(nèi)吞作用攝

5、取納米膠束，主要是網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞，少部分是小窩蛋白介導內(nèi)吞，并且是一個消耗能量的內(nèi)吞過程。熒光顯微鏡觀察冷休克后溫敏性納米載體膨脹，導致內(nèi)涵體破裂，實現(xiàn)siRNA從內(nèi)涵體逃逸。Western Blot結果證明，負載siRNA的DEC-205-Po-CS納米膠束轉染imDCs3 h后進行冷休克，并且冷休克的時間為15 min時，蛋白的表達量較低，蛋白表達抑制率為（81.81±6.89）%；RT-PCR結果表明，脂質(zhì)體2000轉染組；D

6、EC-205-Po-CS轉染組；DEC-205-Po-CS轉染加冷休克組對DC細胞Bak基因有明顯的抑制作用，均能顯著下調(diào)Bak mRNA的表達。流式細胞儀檢測 DCs凋亡結果，DEC-205-Po-CS加冷休克組 DCs存活率（73.62±3.93）%，明顯高于對照組（28.89±3.09）%和脂質(zhì)體2000轉染組（42.84±2.53）%。
　　結論：本文制備了溫度敏感性 DEC-205修飾的泊洛沙姆接枝殼聚糖聚合物納米膠束，