轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA的雙靶向長(zhǎng)循環(huán)多功能信封式納米基因載體的研究.pdf

1、本課題制備了一種轉(zhuǎn)運(yùn) siRNA的非病毒雙靶向長(zhǎng)循環(huán)多功能信封式納米裝置（Multifunction Envelop-type Nano Device，MEND）。MEND為復(fù)合納米脂質(zhì)體，同時(shí)具有脂質(zhì)體和納米粒的特性，通過對(duì)其脂質(zhì)成分進(jìn)行修飾，達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)和肝癌細(xì)胞雙重靶向的目的，轉(zhuǎn)染效率提高。修飾后的脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)為：甘草次酸（Glycyrrhetinic，GA）-聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）-肽（Pept

2、ide，Pp,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP的底物）-二油酰磷脂酰乙醇胺（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE）。各成分通過酰胺反應(yīng)結(jié)合，核磁共振氫譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；PLL壓縮的siRNA溶液水化脂質(zhì)體薄膜后，得到siRNA-MEND。依次利用透射電鏡、動(dòng)態(tài)光散射法和超濾離心法，檢測(cè) siRNA-MEND的形態(tài)、粒徑電位以及包封率；體外酶解實(shí)驗(yàn)考察siRNA-MEND在血漿中

3、的穩(wěn)定性；采用MTT法和熒光標(biāo)記法，考察siRNA-MEND對(duì)肝癌BEL-7402細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和轉(zhuǎn)染效率；利用K-Ras-siRNA-MEND對(duì)BEL-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)染，考察細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和基因沉默。結(jié)果表明修飾物GA-PEG-Pp-DOPE成功合成；siRNA-MEND粒子呈光滑的球形，具有明顯的脂質(zhì)雙分子層和指紋結(jié)構(gòu)，其粒徑分布范圍為163.5±20.0nm，平均電位為0.614±0.05mV；MEND對(duì)siRNA的包封率為82.8％

4、。酶解實(shí)驗(yàn)表明MEND可以保護(hù)siRNA免受血漿降解長(zhǎng)達(dá)120h，是裸siRNA的40倍；修飾成分中的肽可以被MMP-2特異性降解。MEND的細(xì)胞毒性小，在MEND轉(zhuǎn)染下細(xì)胞的生長(zhǎng)平均生長(zhǎng)率為87.03±4.65%，siRNA-MEND可以高效率的轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。由K-Ras-siRNA-MEND轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯下降，K-Ras蛋白的表達(dá)水平比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞降低78.61倍。MEND的制備工藝簡(jiǎn)單，對(duì)siRNA具有較強(qiáng)的保護(hù)作