靶向納米轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)siRNA沉默hTERT及Bmi-1基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞的影響.pdf

1、背景和目的：
　　隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）研究的深入，多數(shù)實(shí)體器官的惡性腫瘤中均證實(shí)了CSCs的存在，乳腺癌是其中最早被證實(shí)的。乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem cell，BCSC）的存在是乳腺癌治療后復(fù)發(fā)和進(jìn)展的主要原因，因此靶向性的清除干細(xì)胞可以提高乳腺癌患者的生存率。
　　腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，使得針對(duì)一個(gè)靶點(diǎn)的治療難以獲得非常滿意的效果。針對(duì)腫瘤的化療方案往往是多

2、種藥物聯(lián)合治療。我們?cè)O(shè)想聯(lián)合沉默兩個(gè)對(duì)腫瘤干細(xì)胞更新和分化都有重要調(diào)控作用的因子，可能會(huì)起到更滿意的效果。Bmi-1在細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞自我更新、分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，hTERT是端粒酶激活的限速因子，均為腫瘤防治的重要靶點(diǎn)。
　　RNAi(RNA interference)是靶向治療的重要方法之一，但RNAi轉(zhuǎn)染效率低、易被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解。納米微粒載體高效無(wú)毒且轉(zhuǎn)染效率高。脂質(zhì)體-多聚陽(yáng)離子-核酸復(fù)合物納米微粒載體（Lipi

3、d-polycation-Nucleic acid，LPN）是目前納米載體研究的熱點(diǎn)之一。多聚陽(yáng)離子將核酸分子縮合成納米微粒，其中聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）是一種帶有豐富陽(yáng)離子電荷的多聚陽(yáng)離子載體，縮合后更易于基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)體包裹RNA壓縮成的LPN結(jié)構(gòu)和病毒類似，核心由核酸或其他遺傳物質(zhì)組成，脂質(zhì)外殼保護(hù)核酸和內(nèi)核免受其他核酸酶的降解和分化，由于脂質(zhì)外殼和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)類似，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞或吞噬將目的基因?qū)?/p>

4、入細(xì)胞中，促使LPN與細(xì)胞膜融合，完成轉(zhuǎn)染。
　　分選和鑒定腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells,CSCs）一直是限制CSCs研究的瓶頸。目前分選的方法很多，但都很難在分選后繼續(xù)培養(yǎng)并保留其干細(xì)胞的特性。盡管腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物眾多，但CD44+CD24?/low和ALDH1+仍然是最公認(rèn)的。由于腫瘤異質(zhì)性，對(duì)CD44+CD24?/low細(xì)胞標(biāo)記并分選后，CD44+CD24?/low細(xì)胞比例會(huì)不斷減少。MCF-7是乳腺癌細(xì)胞

5、系中最易成球的細(xì)胞系之一。MCF-7分選后的細(xì)胞經(jīng)體外無(wú)血清培養(yǎng)可以較大程度的保留BCSC的干性。
　　本研究中，我們采用幾個(gè)在干細(xì)胞自我更新和分化中發(fā)揮重要作用的因子，作為CSCs鑒定的標(biāo)志物。SOX2、Oct3/4同表達(dá)于胚胎干細(xì)胞，在自我更新中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Oct3/4與細(xì)胞的全能性分化有著重要的聯(lián)系。Notch是乳腺癌中最被認(rèn)可的靶點(diǎn)之一，被認(rèn)為與腫瘤干細(xì)胞的增殖調(diào)控有關(guān)。
　　本研究通過(guò)納米轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攜帶的siRNA

6、聯(lián)合沉默Bmi-1與hTERT基因，抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7干細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并對(duì)比干細(xì)胞特性及生物學(xué)特性的改變，為靶向治療乳腺癌提供新的思路與途徑。我們將利用BCSC樣細(xì)胞，用LPN介導(dǎo)的Bmi-1-siRNA和hTERT-siRNA轉(zhuǎn)染BCSC，檢測(cè)分選后轉(zhuǎn)染前和和轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h中Bmi-1與hTERT的mRNA及蛋白水平的表達(dá)；檢測(cè)各組細(xì)胞增殖和凋亡情況；檢測(cè)凋亡基因C-MYC、bcl-2的表達(dá)情況；通過(guò)流式細(xì)

7、胞儀檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。
　　第一部分：乳腺癌干細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)
　　方法：
　　1．以CD44+CD24-/low為標(biāo)記物，流式分選法初步分選出高純度的BCSC。
　　2．以O(shè)ct4、SOX-2、Notch1為標(biāo)志物，用流式細(xì)胞儀鑒定分選前后這些標(biāo)志物的變化，證明獲得了純度較高的CSCs。
　　3以ALDH1為標(biāo)志物，用流式再次分選出CD44+CD24-/low/ALDH1的BCSC。
　　4

8、．克隆形成率實(shí)驗(yàn)證實(shí)分選前后細(xì)胞增殖能力的變化。
　　5．裸鼠成瘤率實(shí)驗(yàn)證實(shí)分選前后成瘤能力的變化，證實(shí)獲得的腫瘤干細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。
　　6．分選獲得的BCSC在無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，最長(zhǎng)時(shí)間達(dá)72小時(shí)。結(jié)果：
　　1．流式分選術(shù)分選MCF-7細(xì)胞獲得高純度CD44+CD24-/low細(xì)胞。
　　2．測(cè)定分選前后細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志：CD44+CD24-/low/Oxt4+、CD44+CD24-/low/SO

9、X-2+、CD44+CD24-/low/Notch1+三種細(xì)胞含量分選前后均有明顯差異(P<0.01)。
　　3．ALDH1表型二次分選后獲得CD44+CD24-/low/ALDH1細(xì)胞。
　　4．克隆形成率檢測(cè)分選前后干細(xì)胞克隆形成率差異顯著(P<0.05)。
　　5．干細(xì)胞裸鼠成瘤率的檢測(cè)：分選后細(xì)胞成瘤能力明顯高于分選前的腫瘤細(xì)胞(P<0.05)。
　　6．獲得的干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中呈球形生長(zhǎng)，未出現(xiàn)貼壁

10、和邊集的現(xiàn)象。小結(jié)：
　　1．分選到了純度較高的CD44+CD24-/low/ALDH1的BCSC。
　　2．在較短時(shí)間內(nèi)獲得了體外培養(yǎng)BCSC并保持其干細(xì)胞特性。
　　第二部分：靶向納米轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)siRNA沉默hTERT及Bmi-1基因?qū)D44+CD24-/low乳腺癌細(xì)胞系MCF-7干細(xì)胞影響的體外研究
　　方法：
　　1.取BCSC細(xì)胞分為七組:空白對(duì)照組、PEI組、Bmi-1siRNA組、hTE

11、RTsiRNA組、Bmi-1siRNA LPN轉(zhuǎn)染組、hTERTsiRNA LPN轉(zhuǎn)染組、hTERT+Bmi-1siRNA-LPN轉(zhuǎn)染組。檢測(cè)分選前和分選后轉(zhuǎn)染24h、48h、72h各組細(xì)胞中Bmi-1 mRNA和hTERT mRNA的表達(dá)。
　　2.上述分組檢測(cè)分選前和分選后轉(zhuǎn)染24h、48h、72h各組細(xì)胞中Bmi-1和hTERT的蛋白表達(dá)。
　　3．上述分組MTT法檢測(cè)后分選前和分選后轉(zhuǎn)染24h、48h、72h各組細(xì)胞

12、生長(zhǎng)抑制率。
　　4.上述分組采用IF法檢測(cè)分選前和分選后24h、48h、72h凋亡蛋白BCL-2蛋白、MYC蛋白表達(dá)情況。
　　5．上述分組采用TUNEL法檢測(cè)分選前和分選后轉(zhuǎn)染24h、48h、72h細(xì)胞凋亡率的變化。
　　結(jié)果：
　　1．Real time-PCR檢測(cè)24h、48h、72h各組細(xì)胞中Bmi-1 mRNA和hTERT mRNA的表達(dá)表明：
　　1)分選前轉(zhuǎn)染，Bmi-1和hTERT轉(zhuǎn)染組與

13、空白組相比差異總體顯著（P<0.05）；Bmi-l-hTERT-LPN組與其他各組相比表達(dá)均差異顯著（P<0.05），而與hTERT-LPN組相比，差異不顯著（P>0.05）。
　　2）分選并轉(zhuǎn)染后24 h，轉(zhuǎn)染后與轉(zhuǎn)染前相比，基因表達(dá)明顯比轉(zhuǎn)染前降低，差異顯著（P<0.05）。各組與空白組相比，兩基因表達(dá)差異顯著（P<0.05）；Bmi-l-LPN組與 Bmi-l組相比，hTERT mRNA表達(dá)差異顯著（P<0.05）；hTER

14、T-LPN組與 hTERT相比，基因表達(dá)均差異顯著（P<0.05）；Bmi-l-hTERT-LPN組與各組相比均差異顯著（P<0.05）。
　　3）分選并轉(zhuǎn)染后48h，轉(zhuǎn)染后與轉(zhuǎn)染前相比，基因表達(dá)明顯比轉(zhuǎn)染前降低，差異顯著（P<0.05）。各組與空白組相比，兩基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LPN/siRNA組與非LPN組對(duì)比兩基因表達(dá)總體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Bmi-l-hTERT-LPN組與 Bmi-l、

15、Bmi-l-LPN、hTERT-LPN相比均差異顯著（P<0.05），而與hTERT組表達(dá)差異不顯著（P>0.05）。
　　4）分選并轉(zhuǎn)染后72h，各組與空白組相比，兩基因表達(dá)差異顯著（P<0.05）；Bmi-l-LPN組與Bmi-l組相比，Bmi-1 mRNA表達(dá)差異顯著（P<0.05），hTERT mRNA表達(dá)差異不顯著（P>0.05）；hTERT-LPN組與hTERT相比，兩基因表達(dá)差異不顯著（P>0.05）；Bmi-l-h

16、TERT-LPN組與Bmi-l、Bmi-l-LPN、hTERT、hTERT-LPN相比均差異顯著（P<0.05）。
　　2．Western Blot技術(shù)檢測(cè)24h、48h、72h各組細(xì)胞中Bmi-1和hTERT的蛋白表達(dá)結(jié)果表明：
　　1）分選前，各組與空白組相比，Bmi-1和hTERT蛋白表達(dá)差異顯著（P<0.05）；LPN/siRNA組與非LPN組對(duì)比兩基因表達(dá)總體差異顯著（P<0.05）；Bmi-1-hTERT-LPN

17、組與Bmi-1、Bmi-1-LPN、hTERT、hTERT-LPN相比均差異顯著（P<0.05）。
　　2）分選后轉(zhuǎn)染24 h，各組與空白組相比，兩基因蛋白表達(dá)差異顯著（P<0.05）；Bmi-1-LPN組與Bmi-1組相比，Bmi-1蛋白表達(dá)差異顯著（P<0.05）；hTERT-LPN組與hTERT相比，兩蛋白表達(dá)差異顯著（P<0.05）；Bmi-1-hTERT-LPN組與hTERT、hTERT-LPN、Bmi-1、Bmi-1-

18、LPN相比兩基因蛋白均差異顯著（P<0.05）。
　　3）分選后轉(zhuǎn)染48 h，各組與空白組相比，兩基因蛋白表達(dá)差異顯著（P<0.05）；LPN/siRNA組與非 LPN組對(duì)比兩基因表達(dá)總體差異均顯著（P<0.05） Bmi-1-hTERT-LPN組與Bmi-1、Bmi-1-LPN、hTERT、hTERT-LPN相比兩基因均差異顯著（P<0.05）。
　　4）分選后轉(zhuǎn)染72 h，各組與空白組相比，兩基因蛋白表達(dá)差異顯著（P<0

19、.05）；Bmi-1-hTERT-LPN組與hTERT、hTERT-LPN相比蛋白表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3．MTT法檢測(cè)24h、48h、72h各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率結(jié)果表明：依分組對(duì)照組、PEI組、Bmi-1siRNA組、hTERT siRNA組、Bmi-1siRNA LPN組、hTERT siRNA LPN組、hTERT+Bmi-1siRNA LPN組細(xì)胞凋亡率依次上升，hTERT+Bmi-1siRNA LPN組

20、凋亡率最高。依時(shí)間延長(zhǎng)凋亡率逐漸上升，72h時(shí)各組凋亡率最高。
　　4．IF法蛋白表達(dá)檢測(cè)凋亡基因結(jié)果表明：
　　1）分選前后，BCL-2蛋白表達(dá)對(duì)比。
　　分選前，各組與空白組相比，BCL-2表達(dá)差異顯著（P<0.05）；
　　分選后，各組與空白組相比，BCL-2表達(dá)差異顯著（P<0.05）；LPN/siRNA組與非LPN組對(duì)比BCL-2表達(dá)差異均顯著（P<0.05）；Bmi-1-hTERT-LPN組與Bmi-

21、1、Bmi-1-LPN、hTERT、hTERT-LPN相比BCL-2表達(dá)差異顯著（P<0.05）。
　　2）分選前后，MYC蛋白表達(dá)對(duì)比。
　　分選前，各組與空白組相比，Bmi-l-LPN組與Bmi-l組相比，LPN/siRNA組與非LPN組對(duì)比，Bmil-LPN+TERT-LPN組與Bmil、TERT、Bmil-LPN、TERT-LPN相比MYC表達(dá)均差異不顯著（P>0.05）。
　　分選后，各組與空白組相比，MYC

22、表達(dá)差異顯著（P<0.05）；LPN/siRNA組與非LPN組對(duì)比MYC表達(dá)差異均顯著（P<0.05）；Bmi-1-hTERT-LPN組與Bmi-1、Bmi-1-LPN、hTERT、hTERT-LPN相比MYC表達(dá)差異顯著（P<0.05）。
　　5．TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況表明：
　　各組與空白相比，細(xì)胞凋亡差異顯著（P<0.05）；LPN/siRNA組與非LPN組對(duì)比細(xì)胞凋亡顯著（P<0.05）；Bmi-1-hTE

23、RT-LPN組與Bmi-1、Bmi-1-LPN、hTERT、hTERT-LPN相比細(xì)胞凋亡差異顯著（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.納米轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)LPN是一種高效低毒的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其介導(dǎo)的siRNA可以有效地沉默人乳腺癌MCF-7細(xì)胞Bmi-1和hTERT基因的表達(dá)。
　　2．流式分選術(shù)分選到高純度的CD44+CD24-/low/ALDH1的BCSC，并在較短時(shí)間內(nèi)體外培養(yǎng)BCSC。
　　3.靶向納米轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介