癌基因Bmi-1的siRNA調(diào)控效應(yīng)及下游靶基因研究.pdf

1、目的：初步探討癌基因Bmi-1的siRNA調(diào)控效應(yīng)及下游靶基因。 方法：針對(duì)Bmi-1mRNA編碼區(qū)設(shè)計(jì)3條siRNA，采用體外化學(xué)合成Bmi-1siRNA，經(jīng)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染具有完整Bmi-1-INK4a基因調(diào)控通路的K562細(xì)胞和缺失INK4a基因的A549細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，MTT法檢測(cè)Bmi-1siRNA轉(zhuǎn)染后2種細(xì)胞的增殖情況，計(jì)算有效Bmi-1siRNA作用下2種細(xì)

2、胞的IC50，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，RT-PCR半定量檢測(cè)Bmi-1mRNA表達(dá)，WesternBlot檢測(cè)Bmi-1、P16和hTERT蛋白表達(dá)。 結(jié)果：(1)轉(zhuǎn)染6h后，熒光檢測(cè)提示2種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率高達(dá)85％；(2)在設(shè)計(jì)的3條siRNA中，僅Bmi-1siRNA1對(duì)2種細(xì)胞增殖的抑制作用呈較好的濃度依賴性，但無(wú)細(xì)胞特異性；(3)Bmi-1siRNA1作用于A549和K562細(xì)胞的IC50分別為83.69nmol/

3、l和87.69nmol/l；(4)轉(zhuǎn)染Bmi-1siRNA1后K562細(xì)胞中G1期比例明顯增加而A549細(xì)胞中G1期比例變化不明顯；(5)轉(zhuǎn)染Bmi-1siRNA1后2種細(xì)胞倍增時(shí)間均顯著延長(zhǎng)；(6)轉(zhuǎn)染24h時(shí)，A549和K562細(xì)胞中Bmi-1mRNA表達(dá)明顯減弱，抑制效率分別為53.88％和58.94％；(7)轉(zhuǎn)染48h時(shí)，A549和K562細(xì)胞中Bmi-1蛋白表達(dá)均明顯降低，抑制效率分別達(dá)到68.86％和70.24％；(8)Bm

4、i-1siRNA1通過(guò)上調(diào)P16蛋白表達(dá)抑制K562細(xì)胞體外增殖；(9)在A549細(xì)胞中Bmi-1siRNA1可下調(diào)hTERT蛋白表達(dá)。 結(jié)論：(1)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)Bmi-1siRNA轉(zhuǎn)染A549和K562細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)；(2)Bmi-1siRNA1能顯著抑制A549和K562細(xì)胞體外增殖，但無(wú)細(xì)胞特異性；(3)Bmi-1siRNA1可有效抑制A549和K562細(xì)胞中Bmi