用全長基因尋靶技術篩選靶向pai1+mrna的反義核酸及sirna

1、中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院博士后學位論文用全長基因尋靶技術篩選靶向PAI1mRNA的反義核酸及siRNA姓名：楊長春申請學位級別：博士后專業(yè)：藥物分析學指導教師：王升啟20050801首先應用R1：PcR方法克隆PAIl全長基因，體外轉錄大量mRNA：將合成的單鏈寡核苷酸庫與mRNA進行雜交，經(jīng)洗脫、PcR擴增、克隆及測序獲得一系列與靶基因結合的位點在對這些位點進行生物信息學分析的基礎上，找到與靶基因的熱點結合部位：根據(jù)這些熱點結合部

2、位設計探針21條，在基因芯片上進行再篩選和優(yōu)化：綜合篩庫和芯片雜交結果，合成15條硫代修飾的反義寡核苷酸，在細胞水平進行驗證。以脂質體將其分別轉染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(HuvEc)，結果發(fā)現(xiàn)，轉染后48k在反義核酸濃度為1o洲幾時，15條反義序列中有】4條(93％)能明顯降低PAI1Ag水平(，(O05)。在此基礎上，我們挑選5條作用明顯的有效序列(4#、5#、御、8#、lo#AsODN)進一步研究表明，結果發(fā)現(xiàn)，反義核酸濃度在o

3、1，025。05，10“M幾時，該s條ASODN可有效抑制PAI1mRNA表達、Ag水平及活性，且呈劑量依賴性。上述結果提示，應用全長基因尋靶技術可以同時在全長基因范圍內發(fā)現(xiàn)熱點靶位，而且理論上，遺漏最佳位點的可能性小，實現(xiàn)了對AsoDN最佳結合位點的高通量篩選；靶向PAI一1mRNA的AsODN可通過抑制PAI1mRNA翻譯成蛋白質而降低了Pc~I1A疊水平和活性，該作用機制與傳統(tǒng)的溶栓藥物及目前從蛋自水平抑制PAI1的溶栓藥物作用機

4、制有根本不同，因此有望成為心血管疾病特別是血栓性疾病治療的一種新型侯選溶栓反義藥物。2靶向PAI1mRNAsiRNA有效序列的篩選與細胞學驗證通過全長基因尋靶技術，獲得了5條反義有效序列。在此基礎上，合成2條(5#、10#)有潛在高活性的與靶mRNA互補的蚶ⅢA，與載體連接構建siRNA表達質粒，應用脂質體2000轉染體外培養(yǎng)的HUVEc，觀察siRNA對血管內皮細胞PAI1mRNA表達、Ag水平和活性的抑制作用。實驗結果顯示，sjRN

5、A對PAI一】mRNA表達、Ag和活性有明顯的抑制作閣。PA一siRNA濃度在1p∥ml，2“g，ml，4p咖1范圍內，可有效抑制PAI一1lnRNA，Ag表達及活性，呈劑量依賴性。上述結果提示，應用全長基因尋靶技術篩選出的反義位點設計的反義寡核苷酸(As0DN)的最佳結合位點與siRNA的作用位點有很好的相關性，反義寡核苷酸(AsoDN)的最佳結合位點可能就是高活性siRNA的作用位點；本課題設計的siRNA不僅與PAI1mRNA的堿

6、基互補，而且是經(jīng)過最佳反義結合位點的篩選進行定向設計的，其特異性和有效性是預測的；靶向P_AI1siRNA有效序列對血管內皮細胞PAI1表達和活性有明顯的抑制作用，其機制與高效、特異引起轉錄后PAI1基因沉默有關：與現(xiàn)有的基因治療藥物相比，siRNA具有治療理論新穎、藥效特異、作用時間長等特色，并且siRNA為內源性活性物質，安全性好，靶向PAIIsiRNA有效序列有望成為新型溶栓基因藥物。綜述Il上工作，通過全長基因尋靶技術，篩選出5