運用反義核酸及TF decoy技術針對豬內(nèi)皮細胞α1，3GT基因啟動子B的研究.pdf

1、第一部分 Oligofectamine介導轉錄因子SP1 反義及誘騙性寡核苷酸轉染豬內(nèi)皮細胞系條件的優(yōu)化研究
　　 目的：研究擬探索確定高效、穩(wěn)定的轉錄因子SP1 反義及誘騙性寡核苷酸(AS-ODN 及decoy ODNs)在oligofectamine介導下轉染豬血管內(nèi)皮細胞系(SV-40-PED)的最佳轉染條件和效果，為以轉錄因子為靶點的基因治療在抑制異種排斥反應中的應用奠定基礎。
　　 方法：針對豬α 1,3GT基

2、因上游調控序列中4個特異啟動子中的啟動子B，設計并生物合成數(shù)條寡核苷酸分子(AS-ODN、decoy ODNs 及錯配ODNs)，運用oligofectamine轉染體系轉染永生化豬血管內(nèi)皮細胞系SV-40-PED。分別應用流式細胞儀和顯微熒光技術，同時測定細胞乳酸脫氫酶(LDH)的含量評價各組PEC的攝取情況以及寡核苷酸分子脂質體轉染對PEC 生長的影響情況。
　　 結果：SV-40-PED在oligofectamine的介導

3、下可以攝取SP1 AS-ODN 及SP1 decoyODNs。在6 孔培養(yǎng)板中，當SP1 decoy ODNs 終濃度為250nM、轉染26 h 時，轉染效率最佳，其攝取率為(93.37±0.85[％])，熒光強度為(200.30±12.22)；同時細胞毒性相對較低(乳酸脫氫酶含量為(49.61±17.13)U/L)；此時細胞內(nèi)熒光物質主要聚集于細胞核。而錯配組與陰性對照組相比未見明顯不同。
　　 結論：Oligofectami

4、ne 轉染體系是一種高效、低毒的寡核苷酸轉染方式。SP1 ODNs終濃度為250 nM、轉染26 h 時可以為豬內(nèi)皮細胞系的轉染提供良好效果。本研究為以轉錄因子為靶點的基因治療在抑制異種排斥反應中的應用奠定了良好基礎。
　　 第二部分轉錄因子SP1 反義及誘騙性寡核苷酸對豬內(nèi)皮細胞α半乳糖苷鏈表達的影響
　　 目的：本研究旨在進一步評價SP1 AS-ODN 及SP1 decoy ODNs 對豬內(nèi)皮細胞α 1,3-GT基因

5、及α-Gal蛋白表達的影響。
　　 方法：SP1 反義(SP1 AS-ODN)及誘騙性寡核苷酸(SP1 decoy ODNs)轉染豬血管內(nèi)皮細胞系，細胞爬片后熒光顯微鏡下觀察α半乳糖糖鏈(α Gal)抗原表位的表達；蛋白印跡法(Western blot)檢測蛋白表達情況；流式細胞學檢測轉染后豬血管內(nèi)皮細胞系膜蛋白α Gal的表達；RT-PCR 法檢測SV-40-PED 轉染前后α 1,3 半乳糖轉移酶(α 1,3GT)m RNA

6、。
　　 結果：熒光顯微鏡下細胞爬片可見轉染組(SP1 decoy ODNs組)細胞膜熒光表達明顯減弱,部分部位可見點狀熒光缺損。Western blot 顯示decoy ODNs /PED的α Gal的相對吸光度值為(48.2±0.9)，僅為空轉染組(只含有轉染試劑oligofectamine)(91.6±1.7)的52.6[％](P<0 .05)。轉染組α 1,3GT基因異構體的mRNA 表達量(異構體1，0.42±0.20

7、 ；異構體2，0.27±0.12)顯著低于空轉染組(異構體1，0.72±0.17 ；異構體2，0.50±0.19 ；p均＜0.05),但錯配組(錯義decoy ODNs組)及空轉染組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：SP1 decoy ODNs 可以靶向性抑制豬內(nèi)皮細胞系α Gal基因的表達，為抑制超急性排斥反應的研究提供了新的思路和策略。
　　 第三部分轉染后豬血管內(nèi)皮細胞系與抗人血清補體細胞毒作用的

8、實驗研究
　　 目的：本研究旨在成功建立對豬血管內(nèi)皮細胞系SV-40-PED 靶向轉染的基礎上，擬用豬血管內(nèi)皮細胞系和人血清建立超急性排斥反應(HAR)體外模型，探討TF decoy技術處理后的豬內(nèi)皮細胞結合抗體/補體能力的變化以及是否具有抗人血清補體介導的細胞毒作用。
　　 方法：在抗體/補體與SV-40-PED 結合實驗中，運用流式細胞儀檢測decoy ODNs 轉染處理SV-40-PED 后結合抗體/補體能力的變化

9、，并通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗評價TF decoy 技術對人血清細胞毒效應的保護作用。
　　 結果：流式細胞學檢測中，decoy ODNs組與空轉染組相比，無論抗體還是補體結合水平均有不同程度的下降，抗體/補體下降程度依次為IgM 68.0[％]，IgG 56.1[％]，C3c55.1[％](P<0.05)。20[％]正常人血清(normal human serum，NHS)及40[％]NHS 對空轉染組和錯配組SV-40

10、-PED 均有不同程度的殺傷能力，而decoy ODNs 轉染SV-40-PED 后即可呈現(xiàn)出對此效應的保護作用，與空轉染組相比，20[％]NHS組和40[％]NHS組其靶細胞溶解率分別下降15.0[％]和30.2[％] (P<0.05)，表現(xiàn)為補體對SV-40-PED的殺傷率不同程度的下降?？辙D染組和錯配組間殺傷率無明顯差異(P>0.05)，熱滅活正常人血清(heat-inactivated NHS，HINHS)作為陰性對照對各組SV

11、-40-PED 均表現(xiàn)出背景毒性作用。
　　 結論：在體外補體介導的細胞毒反應中，decoy ODNs 轉染豬內(nèi)皮細胞SV-40-PED可以呈現(xiàn)出其保護作用。
　　 第四部分轉染后豬血管內(nèi)皮細胞系與人外周血單個核細胞之間的作用研究
　　 目的：建立人外周血單個核細胞和豬血管內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)研究模型,在體外模擬異種移植物內(nèi)皮細胞與人血清相互作用的過程，探討decoy ODNs在人PBMC 對豬血管內(nèi)皮細胞單向混合培

12、養(yǎng)實驗中的影響。
　　 方法：SV-40-PED 轉染后分別運用氚3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法和MTT 法檢測人外周血單個核細胞和豬血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)模型中人PBMC的增殖情況，探討人外周血單個核細胞與轉染前后豬內(nèi)皮細胞相互作用的變化。
　　 結果：未加入刺激細胞的人外周血單個核細胞增生微弱，加入經(jīng)絲裂霉素C處理的異種刺激細胞SV-40-PED 后，各組人外周血單個核細胞均分裂增生，并在5～7d左右逐漸達到最大。在

13、共培養(yǎng)第5天，3H-TdR 法檢測顯示decoy ODNs 轉染組的cpm 值的下降程度為空轉染組的67.1[％]，空轉染組和錯配組的組間比較無明顯差異(P＜0.05)。
　　 Decoy ODNs 轉染處理SV-40-PED 后第5天，MTT 法顯示人PBMC的增殖能力僅為空轉染組的39.2[％] (P<0.05)，呈現(xiàn)出對豬血管內(nèi)皮細胞的保護作用。
　　 結論：在人外周血單個核細胞和豬血管內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)研究模型中，