人內皮細胞高表達脂多糖相關因子1（EOLA1）的啟動子克隆及初步鑒定.pdf

1、人類基因組計劃完成后，絕大多數基因得到了定位。深入研究這些基因的功能，闡明其在生命活動中的意義成為后基因組時代的主要任務。迄今為止，大部分基因功能得到了較深的認識，但還有部分基因的功能和轉錄調控機制仍不清楚，這其中包括內皮高表達脂多糖相關因子1(EOLA1)基因。 EOLA1基因是我們實驗室在前期研究工作中應用抑制消減雜交(SSH)和cDNA末端擴增技術(RACE)，從脂多糖(LPs)刺激后的人臍靜脈內皮細胞中克隆到一個人類新

2、基因全長cDNA序列，經Northernblot驗證后作為人類新基因被GenBank全長序列庫所接受(NoAY074889)。因其在受LPS刺激的內皮細胞中上調表達，故命名為內皮高表達脂多糖相關因子1(endothelial-overexpressedlipopolysaccharide-associatedfactor1，EOLA1)。對該基因的特性已完成的研究顯示其轉錄序列全長為1404個bp，定位于染色體Xq27.4，編碼蛋白由1

3、58個氨基酸組成，分子量17.89kDa，等電點6.43，親水性好，為可溶性蛋白。其二級結構含α螺旋、β片層結構和β轉角，并形成一個螺旋一轉角-螺旋(HTH)基序。EOLA1氨基酸序列包含N-糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點和酪氨酸激酶2磷酸化位點。 多組織Northernblot顯示EOLA1基因除在LPS刺激的內皮細胞上調表達外，在正常成人心臟、骨胳肌、腎臟、肝臟和胎盤有較強的表達，在脾臟、結腸和小腸表達較弱，而在腦、胸腺

4、、肺和外周白細胞則未見表達。在7種癌細胞株上，顯示在早幼粒白血病系HL-60、海拉細胞系S3、慢性白血病K-562細胞系都有表達，以在白血病細胞系MOLT-4和腺癌細胞系SW480表達為最高，但在肺癌細胞系A549和黑素瘤細胞系G-361無表達。在經過G418壓力篩選后的穩(wěn)定表達EGFP-EOLA1(enhancedgreenfluorescentprotein-EOLA1)融合蛋白的ECV304細胞株中發(fā)現EOLA1蛋白為全細胞分布。

5、酵母雙雜交顯示EOLA1蛋白與細胞內金屬硫蛋白相互作用，調控細胞增殖，參與炎癥反應時細胞內保護機制。但確切的EOLA1基因功能和其調控機制仍不清楚。 為幫助明確基因的功能，了解基因在不同組織和細胞中差異表達的原因，闡明其轉錄調控機制是必不可少的步驟?；蜣D錄調控主要由啟動子、增強子和沉默子、順式作用元件和與其相互結合的反式作用因子構成。其中，啟動子提供了基本的轉錄活性，多數基因啟動子具有典型的TATA盒結構，而不具有TATA盒

6、的啟動子基因，常有多個轉錄起始位點。有研究顯示EOLA1基因mRNA轉錄本存在兩種不同的剪切形式，其原因可能與轉錄起始位點不同相關。另外，轉錄因子與順式作用元件的結合既可能增強啟動子的活性促使轉錄，也可能抑制啟動子的活性阻滯轉錄，從而使目的基因在不同細胞或同一細胞不同狀態(tài)時表現出轉錄的差異。為此，本研究首先克隆EOLA1基因5’-側翼區(qū)約2.4kb的基因組DNA序列，再缺失突變?yōu)閮蓚€不同長度的片段，分別插入雙熒光素酶報告基因表達質粒，轉

7、染細胞后，瞬時表達，通過檢測報告基因活性的變化來反映5’-側翼區(qū)內啟動子區(qū)域，利用生物信息學方法預測其啟動子并與實驗結果相對照，為全面闡明EOLA1表達調控機制提供基本數據。 本研究的主要結果和結論如下： 培養(yǎng)ECV304細胞，從該細胞中抽提基因組DNA，并以該基因組DNA作模板采用PCR方法擴增到EOLA1基因上游3個不同長度的基因片段，然后應用pGL3-Basic空質粒和PCR產物構建重組質粒，轉化到大腸桿菌DH

8、5a，篩選陽性克隆，構建得到不同長度片段啟動子-熒光素酶載體：pGL3-Basic-1076bp、pGL3-Basic-1723bp、pGL3-Basic-2426bp。并經限制性內切酶酶切鑒定，測序證明克隆基因片段插入方向正確，插入的接頭處核苷酸序列正常，未發(fā)現堿基突變。因此pGL3-Basic-EOLA1系列重組體構建成功。 將上面構建所得的重組質粒與內參照質粒pRL-TK共轉染ECV-304細胞，檢測報告基因相對熒光活性

9、結果顯示，與pGL3-Basic空載體相比，3種構建的質粒(pGL3-Basic-1076bp、pGL3-Basic-1723bp、pGL3-Basic-2426bp)熒光活性均明顯增強(p＜0.01或p＜0.05)，提示相應的基因序列均具有啟動報告基因轉錄的能力。其中pGL3-Basic-1723bp的轉錄活性最高。 利用生物信息學軟件預測啟動子所在區(qū)域結果顯示：在EOLA1基因5’側翼區(qū)-671～-721區(qū)存在啟動子的預測