人肺癌細(xì)胞中microRNA let-7a-1-7f-1啟動(dòng)子的克隆及其功能的初步分析.pdf

1、一、研究背景
　　 microRNAs(miRNA)是一類廣泛存在于多種生物體的非編碼小RNA，其長(zhǎng)度通常為22bp左右。microRNAs分子可通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)完全或不完全的配對(duì)來降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。通過對(duì)靶基因的負(fù)向調(diào)控，microRNA參與調(diào)節(jié)著多種生物學(xué)過程，如早期發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡等，而miRNA的異常則與多種疾病和腫瘤相關(guān)。目前研究發(fā)

2、現(xiàn)約50％已得到注解的microRNAs在人類基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn);某些組織特異性microRNA基因表達(dá)圖譜的改變可見于乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、肺癌、垂體瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種腫瘤組織中，提示表明miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前認(rèn)為，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展既可作為抑癌基因下調(diào)原癌基因的活性，也可作為癌基因下調(diào)抑癌基因的活性。因此研究miRNA在腫瘤中的作用有助于全面而深入地探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并可為

3、腫瘤的臨床診斷與治療提供新靶點(diǎn)。
　　 let-7家族是最早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，在成人組織中廣泛表達(dá)（has-let-7），以肺組織的表達(dá)豐度最高。Takamizawa等發(fā)現(xiàn)肺癌患者的let-7表達(dá)水平顯著降低，并且let-7表達(dá)水平低的患者經(jīng)手術(shù)切除治療后，預(yù)后較差。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，在人肺癌細(xì)胞中高表達(dá)let-7則可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖。這說明let-7是具有抑癌作用的miRNA，與肺癌高度相關(guān)，有望成為肺癌分子靶向治

4、療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
　　 目前對(duì)let-7在肺癌組織細(xì)胞中低表達(dá)的機(jī)制尚缺乏全面信息，而Takamizawa及Yanaihara等研究者通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)到在肺癌組織細(xì)胞中pri-hsa-let-7表達(dá)水平下降，提示轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控異常至少是hsa-let-7低表達(dá)的部分原因。但目前對(duì)hsa-let-7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。本課題選取let-7家族中含量最豐富，且成簇位于9q22.32的let-7a-1和l

5、et-7f-1作為切入點(diǎn)，對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　 二、研究目的
　　 鑒定miRNA簇let-7a-1/7f-1的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，克隆其啟動(dòng)子，并對(duì)let-7a-1/7f-1啟動(dòng)子的功能進(jìn)行初步分析，為探討let-7a-1/7f-1在肺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 首先通過5'RACE確定let-7a-1/7f-1的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，繼而通過PCR擴(kuò)增let-7a-1/7

6、f-1基因5’上游2123bp的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)片段(-1999bp/+124bp)，插入熒光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒pGL3-Basic，構(gòu)建let-7a-1/7f-1啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒pGL3-2123，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。然后對(duì)pGL3-2123的啟動(dòng)子功能進(jìn)行初步分析。pGL3-2123瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，分別經(jīng)過9-順維甲酸(9cRA)、全反式維甲酸(AT-RA)、地塞米松(DEX)或1，25-(OH)2

7、D3處理48h或?qū)GL3-2123分別與真核表達(dá)載體pCMV-p53，pcDNA3.1(+)-Sp1，pcDNA3.1(+)-NFκBp50,pcDNA3.1(+)-PPARγ2,pcDNA3.1(+)-c/EBPα,pBABEpuro-ras或pBABEhygro-myc共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h，收取細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶活性的檢測(cè)，觀察它們對(duì)A549細(xì)胞中l(wèi)et-7a-1/7f-1啟動(dòng)子活性的影響。
　　 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

8、>　　 通過5'RACE，確定了let-7a-1/7f-1的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn);PCR擴(kuò)增的let-7a-1/7f-1基因5’上游2123bp啟動(dòng)子片段與熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建成的融合質(zhì)粒(pGL3-2123)經(jīng)酶切電泳及測(cè)序鑒定正確;pGL3-2123質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，雙熒光素酶活性測(cè)定M1/M2為5.24，而pGL3-control和pGL3-basic的相對(duì)熒光素酶活性M1/M2分別為38.76和0.26。DEX能夠增強(qiáng)1

9、et-7a-1/7f-1啟動(dòng)子的活性，但ATRA，9cRA，1，25-(OH)2D3對(duì)let-7a-1/7f-1啟動(dòng)子的活性沒有產(chǎn)生明顯影響。腫瘤相關(guān)因子c/EBPα和p53的真核表達(dá)載體與pGL3-2123共轉(zhuǎn)染時(shí)，能夠增強(qiáng)let-7a-1/7f-1的啟動(dòng)子活性;而共轉(zhuǎn)染的PPARγ2，NF-KappaB，Sp1，ras和myc的真核表達(dá)載體對(duì)let-7a-1/7f-1啟動(dòng)子的活性沒有明顯影響。
　　 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　

10、 成功鑒定了microRNA簇let-7a-1/7f-1的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，構(gòu)建了2.1kb的let-7a-1/7f-1啟動(dòng)調(diào)控區(qū)-熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-2123;該質(zhì)粒經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因分析，檢測(cè)到了明顯但相對(duì)于陽性對(duì)照較低的啟動(dòng)子活性，這與let-7a-1/7f-1在肺癌A549細(xì)胞中發(fā)生了表達(dá)下調(diào)相一致。腫瘤相關(guān)因子c/EBPα和p53以及糖皮質(zhì)類激素藥物地塞米松(DEX)能夠增強(qiáng)肺癌細(xì)胞中該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。這一研究結(jié)果為