TTF-1啟動(dòng)子調(diào)控miR-7表達(dá)對人肺癌裸鼠模型腫瘤生長的影響.pdf

1、目的：⑴常規(guī)建立人肺癌裸鼠荷瘤模型，結(jié)合HE染色、免疫熒光（Ki-67、TUNEL）、原位雜交、實(shí)時(shí)熒光定量PCR，觀察TTF-1啟動(dòng)子靶向表達(dá)miR-7對人肺癌模型腫瘤生長的影響。⑵利用腫瘤組織cDNA基因芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）和Western blot等技術(shù)，并結(jié)合過表達(dá)靶分子等初步探討TTF-1啟動(dòng)子靶向調(diào)控miR-7表達(dá)對人肺癌體內(nèi)生長的可能分子機(jī)制。
　　方法：①建立人肺癌裸鼠腫瘤模型。于

2、模型建立后在腫瘤對側(cè)遠(yuǎn)端皮下分別注射100 mg p-T-miR-7重組質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒（每組各10只），每隔3天注射一次，連續(xù)注射5次，并每3天測量一次腫瘤大小。末次注射3天后，麻醉處死模型小鼠。取腫瘤組織和肺組織，HE染色觀察其組織形態(tài)學(xué)變化；免疫熒光技術(shù)檢測腫瘤組織中增殖核抗原Ki-67蛋白的表達(dá)變化；TUNEL法檢測腫瘤局部細(xì)胞凋亡情況；Real-time PCR和原位雜交檢測腫瘤組織中miR-7的表達(dá);此外，利用Real

3、-time PCR檢測與腫瘤細(xì)胞生長周期相關(guān)的蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)變化，以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)變化。最后，利用Western blot檢測相關(guān)信號途徑，包括Akt/Erk等信號通路的傳遞改變。②提取人肺癌95D移植瘤模型中p-Cont組和p-T-miR-7組中腫瘤組織，送cDNA基因芯片檢測，篩選出差異表達(dá)基因；進(jìn)一步運(yùn)用生物信息學(xué)

4、技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)篩選miR-7可能作用的靶分子，經(jīng)篩選選定NDUFA4作為miR-7的候選靶分子，并用Western blot和免疫組化驗(yàn)證其表達(dá)；進(jìn)一步通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)靶分子NDUFA4的真核載體(命名為p-NDUFA4)；并且將p-NDUFA4體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞，Real-time PCR檢測NDUFA4的表達(dá)水平；通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后NDUFA4對人肺癌細(xì)胞的

5、增殖、遷移和克隆形成能力的影響；此外，利用Real-time PCR檢測腫瘤細(xì)胞生長周期相關(guān)蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)變化，以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)變化。最后，利用Western blot技術(shù)檢測NDUFA4、Akt、Erk、磷酸化 Akt和磷酸化 Erk的表達(dá)水平。為了檢測下調(diào)NDUFA4的表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)TTF-1啟動(dòng)子調(diào)控miR-7表

6、達(dá)對人肺癌體內(nèi)生長的抑制效應(yīng)，我們將p-T-miR-7和p-NDUFA4體外共轉(zhuǎn)染于人肺癌95D細(xì)胞。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長、遷移和克隆形成能力的變化；此外，利用Real-time PCR檢測腫瘤細(xì)胞中NDUFA4、生長周期相關(guān)蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)變化，以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)變化。最后，利用

7、Western blot技術(shù)檢測Akt、Erk、磷酸化 Akt和磷酸化 Erk的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴動(dòng)態(tài)觀察人肺癌裸鼠模型的腫瘤生長，并統(tǒng)計(jì)繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果顯示與p-Cont對照組相比，p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長緩慢(P＜0.05)；荷瘤裸鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示：p-Cont對照組荷瘤裸鼠肺部可見明顯的腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移，p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組鏡下并未觀察到明顯的轉(zhuǎn)移灶。腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示：p-Cont組細(xì)胞

8、形態(tài)不規(guī)則，p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組則可見大片壞死區(qū)；Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組中miR-7的表達(dá)顯著的上調(diào)(P＜0.05)；原位雜交結(jié)果顯示：p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組中miR-7的表達(dá)顯著的上調(diào)(P＜0.05)；免疫熒光法檢測顯示：與p-Cont對照組相比，p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織細(xì)胞Ki-67表達(dá)量顯著減少(P＜0.05)；原位凋亡實(shí)驗(yàn)(TUNEL法)檢測結(jié)果顯示：與p-Cont對照組相

9、比，p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織局部細(xì)胞的凋亡顯著增加；Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:荷瘤模型腫瘤組織細(xì)胞生長周期相關(guān)的蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)均明顯下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Western blot結(jié)果顯示，荷瘤模型腫瘤組織中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

10、(P＜0.05)；在細(xì)胞水平上，Western blot結(jié)果也顯示，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)，與體內(nèi)結(jié)果一致(P＜0.05)。⑵腫瘤組織cDNA微陣列芯片分析篩選出大量差異表達(dá)的基因。與p-Cont組相比，p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組NDUFA4的表達(dá)下調(diào)4.13倍；Real-time PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示，p-T-miR-7實(shí)驗(yàn)組NDUFA4在人肺癌荷瘤腫瘤組織中的表達(dá)均較p-Con

11、t對照組顯著下調(diào)(P＜0.05)；此外，在細(xì)胞水平上，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞后NDUFA4的表達(dá)也顯著下調(diào)(P＜0.05)，提示NDUFA4可能是miR-7的靶分子；進(jìn)一步運(yùn)用Western blot技術(shù)以及免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，與p-Cont對照組相比，腫瘤組織中p-T-miR-7組靶分子NDUFA4蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)；成功構(gòu)建過表達(dá)NDUFA4的真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-NDUFA4,命名為p-NDU

12、FA4），并將該載體體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞；Real-time PCR檢測結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組NADUFA的表達(dá)顯著上調(diào)表達(dá)(P＜0.05)；CCK-8法檢測結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖明顯增加(P＜0.05)；Scratch Assay實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞遷移能力和克隆形成能力均顯著增強(qiáng)(

13、P＜0.05)；與此同時(shí)，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中細(xì)胞生長周期相關(guān)的蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)以及相關(guān)的轉(zhuǎn)移分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)均處于明顯上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；此外，Western blot結(jié)果顯示，與p-Cont組相比，p-NDUFA4轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞內(nèi)NDUFA4、磷酸化

14、Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；最后，為了驗(yàn)證改變NDUFA4的表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)TTF-1啟動(dòng)子調(diào)控miR-7的表達(dá)對人肺癌的抑制效應(yīng)，我們將p-NDUFA4真核過表達(dá)載體,同p-T-miR-7載體于體外瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞來觀察其對細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的可能影響。CCK-8法檢測結(jié)果顯示：與p-T-miR-7單獨(dú)轉(zhuǎn)染組相比，p-T-miR-7+p-NDUFA4共轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖明顯增加，且差異

15、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Scratch Assay實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別顯示：與 p-T-miR-7單獨(dú)轉(zhuǎn)染組相比， p-T-miR-7+p-NDUFA4共轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的遷移能力和克隆形成能力也顯著增強(qiáng)(P＜0.05)；Real-time PCR檢測結(jié)果顯示：p-T-miR-7+p-NDUFA4共轉(zhuǎn)染組NDUFA4的表達(dá)、細(xì)胞生長周期相關(guān)的蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)以及相關(guān)的轉(zhuǎn)移分子E-c

16、adherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)均處于明顯上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；最后，Western blot結(jié)果顯示，與p-T-miR-7單獨(dú)轉(zhuǎn)染組相比，p-T-miR-7+p-NDUFA4共轉(zhuǎn)染組中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；
　　結(jié)論：①TTF-1啟動(dòng)子靶向表達(dá)miR-7可以顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體內(nèi)生長，該效應(yīng)與Akt/Erk信號