CAFs來源的miR-7通過RASSF2調控口腔鱗癌生長和遷移.pdf

1、目的：
　　目前許多研究證實，miRNA在腫瘤的惡性進展中起到關鍵的調節(jié)作用，但在不同部位或組織內相關miRNA的表達及所涉及的通路均存在差異；因此，本實驗通過miRNA表達譜芯片，檢測腫瘤成纖維細胞中異常表達的特定miRNA對口腔鱗癌的作用，并進一步對其所涉及的靶基因生物學作用進行研究。
　　方法：
　　本實驗選取臨床口腔鱗癌組織，原代培養(yǎng)癌組織（8例）與癌旁組織（8例）中成纖維細胞（normal fibroblas

2、ts,NFs）與腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）。通過免疫熒光，蛋白免疫印跡等手段鑒定二者成纖維細胞的表型。通過體外實驗驗證NFs與CAFs的生長增殖與遷移能力，以及NFs與CAFs分別對口腔鱗癌細胞的作用。通過miRNA表達譜芯片檢測在CAFs中異常表達的miRNA。采用實時熒光定量PCR在臨床樣本中，檢驗CAFs中差異表達的miRNAs。采用共培養(yǎng)方式，檢測NFs與CAFs對

3、口腔鱗癌細胞增殖、侵襲、轉移、細胞周期和細胞凋亡等生物學功能學方面的影響；采用0.8μm transwell小室鑒別NFs與CAFs的遷移能力，通過轉染mimics及inhibitor分別干擾NFs與CAFs中的miRNAs表達水平，觀察兩組成纖維細胞在生長及遷移能力方面的變化，以及對口腔鱗癌細胞增殖及侵襲方面的影響，評價候選miRNA在成纖維細胞與腫瘤細胞相互作用過程中的作用；通過生物信息學數(shù)據(jù)庫及雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)，預測候選mi

4、RNA的靶基因，及其相關調控作用及作用機制。
　　結果：
　　口腔鱗癌患者來源的癌組織及癌旁組織中，癌巢周邊的基質細胞群中明顯高表達CAFs的生物標記物α-SMA，而癌旁正常組織中的基質細胞未見α-SMA明顯表達。從口腔鱗癌患者的癌組織及癌旁正常組織中，分離并培養(yǎng)成纖維細胞；應用臨床口腔鱗癌患者的癌與癌旁組織原代培養(yǎng)成纖維細胞，對其表型進行鑒定；通過蛋白免疫印跡，免疫熒光等實驗技術證實，從口腔鱗癌組織中培養(yǎng)獲得的成纖維細胞為

5、CAFs，而從癌旁正常組織中獲得的成纖維細胞為NFs。CCK-8體外增殖實驗證實，CAFs增長速度明顯快于NFs（p<0.001）。Transwell小室實驗證實，CAFs在48小時內的遷移能力明顯強于NFs。應用來自2種成纖維細胞的RNA，進行miRNA基因芯片檢測，發(fā)現(xiàn)有9個miRNAs在CAFs中明顯高表達；通過 Real-time PCR在口腔鱗癌組織樣本驗證后發(fā)現(xiàn)，miR-7，miR-196，miR-335變化較為明顯。通過體

6、外轉染miR-7 mimics和inhibitor，發(fā)現(xiàn)miR-7在CAFs的表達明顯降低或升高（p=0.004）；通過共培養(yǎng)實驗證實，miR-7能夠明顯促進成纖維細胞誘導的口腔鱗癌細胞的增殖及遷移。生物數(shù)據(jù)庫及雙熒光素酶報告分析發(fā)現(xiàn)，miR-7可對其靶基因RASSF2進行負性調控；通過抑制RASSF2表達，發(fā)現(xiàn)其可促使NFs促進口腔鱗癌的生長及侵襲；當在CAFs中高表達RASSF2，可抑制miR-7的作用，對腫瘤細胞的生長和侵襲產(chǎn)生明