CAFs來源的miR-7通過RASSF2調(diào)控口腔鱗癌生長(zhǎng)和遷移.pdf

1、目的：
　　目前許多研究證實(shí)，miRNA在腫瘤的惡性進(jìn)展中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，但在不同部位或組織內(nèi)相關(guān)miRNA的表達(dá)及所涉及的通路均存在差異；因此，本實(shí)驗(yàn)通過miRNA表達(dá)譜芯片，檢測(cè)腫瘤成纖維細(xì)胞中異常表達(dá)的特定miRNA對(duì)口腔鱗癌的作用，并進(jìn)一步對(duì)其所涉及的靶基因生物學(xué)作用進(jìn)行研究。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)選取臨床口腔鱗癌組織，原代培養(yǎng)癌組織（8例）與癌旁組織（8例）中成纖維細(xì)胞（normal fibroblas

2、ts,NFs）與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）。通過免疫熒光，蛋白免疫印跡等手段鑒定二者成纖維細(xì)胞的表型。通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NFs與CAFs的生長(zhǎng)增殖與遷移能力，以及NFs與CAFs分別對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的作用。通過miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)在CAFs中異常表達(dá)的miRNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床樣本中，檢驗(yàn)CAFs中差異表達(dá)的miRNAs。采用共培養(yǎng)方式，檢測(cè)NFs與CAFs對(duì)

3、口腔鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能學(xué)方面的影響；采用0.8μm transwell小室鑒別NFs與CAFs的遷移能力，通過轉(zhuǎn)染mimics及inhibitor分別干擾NFs與CAFs中的miRNAs表達(dá)水平，觀察兩組成纖維細(xì)胞在生長(zhǎng)及遷移能力方面的變化，以及對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖及侵襲方面的影響，評(píng)價(jià)候選miRNA在成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用過程中的作用；通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)，預(yù)測(cè)候選mi

4、RNA的靶基因，及其相關(guān)調(diào)控作用及作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　口腔鱗癌患者來源的癌組織及癌旁組織中，癌巢周邊的基質(zhì)細(xì)胞群中明顯高表達(dá)CAFs的生物標(biāo)記物α-SMA，而癌旁正常組織中的基質(zhì)細(xì)胞未見α-SMA明顯表達(dá)。從口腔鱗癌患者的癌組織及癌旁正常組織中，分離并培養(yǎng)成纖維細(xì)胞；應(yīng)用臨床口腔鱗癌患者的癌與癌旁組織原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，對(duì)其表型進(jìn)行鑒定；通過蛋白免疫印跡，免疫熒光等實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí)，從口腔鱗癌組織中培養(yǎng)獲得的成纖維細(xì)胞為

5、CAFs，而從癌旁正常組織中獲得的成纖維細(xì)胞為NFs。CCK-8體外增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CAFs增長(zhǎng)速度明顯快于NFs（p<0.001）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CAFs在48小時(shí)內(nèi)的遷移能力明顯強(qiáng)于NFs。應(yīng)用來自2種成纖維細(xì)胞的RNA，進(jìn)行miRNA基因芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)miRNAs在CAFs中明顯高表達(dá)；通過 Real-time PCR在口腔鱗癌組織樣本驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，miR-7，miR-196，miR-335變化較為明顯。通過體

6、外轉(zhuǎn)染miR-7 mimics和inhibitor，發(fā)現(xiàn)miR-7在CAFs的表達(dá)明顯降低或升高（p=0.004）；通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-7能夠明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的口腔鱗癌細(xì)胞的增殖及遷移。生物數(shù)據(jù)庫(kù)及雙熒光素酶報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)，miR-7可對(duì)其靶基因RASSF2進(jìn)行負(fù)性調(diào)控；通過抑制RASSF2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可促使NFs促進(jìn)口腔鱗癌的生長(zhǎng)及侵襲；當(dāng)在CAFs中高表達(dá)RASSF2，可抑制miR-7的作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲產(chǎn)生明