mir-638通過對(duì)VEGFA的調(diào)控參與AML骨髓血管新生的研究.pdf

1、研究背景：
　　急性白血病是血液系統(tǒng)常見的惡性疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，盡管在過去的十年，對(duì)該疾病的診斷及治療方面有長足的進(jìn)步，研究其發(fā)病機(jī)制和相應(yīng)的治療策略仍然是血液學(xué)界重要的課題。以往的研究中，學(xué)者們大都關(guān)注白血病干細(xì)胞本身如細(xì)胞表面抗原變化、細(xì)胞遺傳學(xué)改變、基因的重組、突變等。近些年的研究資料顯示，骨髓造血微環(huán)境的改變也是參與其中的重要因素，白血病細(xì)胞在造血微環(huán)境中增殖，并不斷促進(jìn)其發(fā)生變化，造血微環(huán)境的改變也為白血病細(xì)

2、胞提供了必要的生長條件，二者共同促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。骨髓血管新生是骨髓造因微環(huán)境改變的一項(xiàng)重要病理過程，其主要參與者包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞因子、信號(hào)傳導(dǎo)通路及白血病干細(xì)胞本身。在這個(gè)過程中，參與其中的誘導(dǎo)因子表達(dá)上調(diào)，而抑制因子相對(duì)減弱，刺激循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤周圍遷移、增殖，形成新生的血管。在眾多因子中，目前認(rèn)為起關(guān)鍵作用的是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，它在血液系統(tǒng)腫瘤中的研究在不斷進(jìn)展中。上世紀(jì)90年代，骨髓血管新生現(xiàn)象在多發(fā)性骨髓

3、瘤患者中被發(fā)現(xiàn)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象也同樣存在于急性白血病中。隨著分子生物學(xué)的飛速進(jìn)展，人們對(duì)腫瘤治療的目標(biāo)，已不再滿足于細(xì)胞和蛋白水平。一般認(rèn)為，下調(diào)特定基因的mRNA表達(dá)策略是研究基因功能及有希望治療腫瘤的有效途徑。在分子水平控制基因表達(dá)已經(jīng)成為重要的課題，miRNA的發(fā)現(xiàn)，給這個(gè)課題帶來了新的希望。
　　MicroRNAs(miRNAs)在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控起著重要的作用，其本身并不改變基因序列，而是與靶基因互相作用，通過上調(diào)

4、或抑制其表達(dá)而發(fā)揮調(diào)控作用。mi RNAs參與了真核生物幾乎所有的生物學(xué)過程，另外被發(fā)現(xiàn)的miRNAs多數(shù)位于脆性位點(diǎn)與癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。多個(gè)研究報(bào)告表明，miRNA參與了內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，miRNA表達(dá)譜往往是觀察各類疾病的生物學(xué)指標(biāo)。許多miRNAs在血漿中能被檢測出來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷成熟，其不僅可能成為一些疾病的生物學(xué)標(biāo)記，還可能對(duì)疾病分型、評(píng)估療效及判斷預(yù)后有重要參考意義。
　　活

5、躍的血管生成是導(dǎo)致腫瘤患者快速復(fù)發(fā)和低生存率的重要原因。眾多miRNAs參與了這個(gè)過程。然而，確定miRNA與血管新生的關(guān)系是十分復(fù)雜過程，具有巨大的挑戰(zhàn)性，因?yàn)橐粋€(gè)miRNA可能對(duì)應(yīng)數(shù)百或甚至數(shù)千個(gè)目的基因，一種基因可以受數(shù)目眾多的miRNAs調(diào)控。根據(jù)數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)資料及前期我們對(duì)AML患者血漿中miRNAs表達(dá)譜的篩選研究，發(fā)現(xiàn)miR-638可能以“抑癌基因”角色參與腫瘤血管生成過程，然而其表達(dá)情況及具體機(jī)制尚未清楚。
　　研究

6、目的：
　　觀察急性髓系白血病患者骨髓血管新生情況，并對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞VEGFA-mRNA及miR-638水平進(jìn)行檢測，根據(jù)臨床資料及檢測結(jié)果，分析二者在AML血管新生中可能的作用。進(jìn)一步以白血病細(xì)胞系為研究對(duì)象，上調(diào)或下調(diào)miR-638表達(dá)水平，觀察VEGFAmRNA及蛋白表達(dá)變化。通過臨床觀察及基礎(chǔ)研究，探討miR-638、VEGFA在骨髓血管生成中的作用，并為尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物及新的治療方法奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：

7、
　　臨床研究:
　　1.選取77例急性髓系白血病患者及21列正常人為觀察對(duì)象，免疫組化法以Anti-vWF抗體標(biāo)記微血管內(nèi)皮細(xì)胞，檢測骨髓微血管密度(MVD);收集并分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，qTR-PCR法檢測miR-638、VEGFAmRNA表達(dá)情況。并分別分析MVD、VEGFAmRNA、miR-638與臨床特征的關(guān)系及三者表達(dá)水平相關(guān)性。
　　2.標(biāo)準(zhǔn)化療1周期后，評(píng)估緩解狀態(tài)，收集標(biāo)本，再次檢測骨髓MVD及單個(gè)核細(xì)

8、胞VEGFAmRNA、miR-638表達(dá)水平，與治療前進(jìn)行配對(duì)比較并分析相應(yīng)的變化。
　　基礎(chǔ)研究:
　　1.以白血病細(xì)胞系K562、HL60和人臍靜脈細(xì)胞系HUVECs為研究對(duì)象，常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測miR-638、VEGFA表達(dá)情況。
　　2.上調(diào)/抑制miRNA-638表達(dá)實(shí)驗(yàn)
　　質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR-638mimics及其抑制物miR-638 inhibitor于K562和HL60細(xì)胞株中，用q

9、RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-638、VEGFAmRNA表達(dá)水平，應(yīng)用Western blot法檢測VEGFA蛋白水平變化。
　　3.熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)
　　根據(jù)miR-638與VEGFA3'-UTR端結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增后雙酶切，連接到pmirGLO質(zhì)粒載體中，定點(diǎn)突變VEGFA3'-UTR相應(yīng)的種子序列并連接于載體中，由此分別構(gòu)建了VEGFA野生型3'UTR和突變型3'UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，與miR

10、-638共轉(zhuǎn)染K562和HL60細(xì)胞，以Negative control作為陰性對(duì)照，培養(yǎng)48小時(shí)后加入底物發(fā)光，檢測熒光水平。
　　4.Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
　　以內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs為觀察對(duì)象，應(yīng)用Transwell小室（聚酯膜的孔徑為0.4μm）與轉(zhuǎn)染miR-638及miR-638inhibitor的K562、HL60細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬白血病細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用MTT法檢測HUVECs的增殖情況。<

11、br>　　研究結(jié)果：
　　臨床研究結(jié)果:
　　1.應(yīng)用免疫組化法檢測正常人及AML患者微血管密度(MVD)，高倍顯微鏡下(100×)觀察骨髓切片，發(fā)現(xiàn)vWF標(biāo)記的AML患者骨髓微血管的形態(tài)與正常人存在差異。77例初發(fā)AML患者M(jìn)VD明顯高于正常對(duì)照組，在伴有髓外浸潤者尤為顯著。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化療1周期后，評(píng)估療效，達(dá)CR者60人，NR者17人?；熀蠡颊吖撬鐼VD仍偏高。所有患者治療前后進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，治療后MVD較治療前下降;CR

12、組與NR組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.qRT-PCR法檢測AML患者VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)含量，結(jié)果顯示，初發(fā)AML患者與正常組比較明顯增高，且在高原始細(xì)胞比例組(BM-blasts＞50％)VEGFAmRNA表達(dá)水平明顯高于＜50％組。化療1周期后，VEGFAmRNA表達(dá)水平仍偏高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;所有患者治療前后進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，治療后VEGFAmRNA表達(dá)水平較治療前明顯下降。
　　3.qRT-PCR法檢測骨

13、髓單核核細(xì)胞miR-638表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-638在初發(fā)AML表達(dá)下降，明顯低于正常對(duì)照組;經(jīng)1周期治療后與初發(fā)時(shí)進(jìn)行配對(duì)比較，其表達(dá)上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;NR組miR-638表達(dá)水平仍偏低，與CR組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。按臨床特征分析AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞miR-638表達(dá)情況，其表達(dá)骨髓增生程度，白血病類型、有無髓外浸潤及細(xì)胞遺傳學(xué)改變無相關(guān)性。按骨髓原始細(xì)胞比例分組，AML患者骨髓原始細(xì)胞＞50％組表達(dá)水平明顯低于＜50％組，有

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.將所有AML患者M(jìn)VD與VEGFAmRNA及miR-638相對(duì)表達(dá)含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，MVD與VEGFAmRNA呈顯著正相關(guān)(r=0.583，P＜0.05);miR-638與VEGFAmRNA呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.389，P＜0.05)。
　　5.生存分析骨髓MVD偏低組患者總生存期較偏高組明顯延長，VEGFAmRNA及miR-638相對(duì)表達(dá)含量與生存期無明顯相關(guān)性。
　　基礎(chǔ)研究結(jié)果

15、:
　　1.miR-638在白血病細(xì)胞株K562、HL60中的表達(dá)水平較正常單個(gè)核細(xì)胞明顯減低。以miR-638mimics和miR-638 inhibitor轉(zhuǎn)染K562和HL60細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染后應(yīng)用qRT-PCR法進(jìn)行檢測miR-638表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染miR-638mimics的細(xì)胞株，其表達(dá)水平上調(diào)，明顯高于Negative Control組;而轉(zhuǎn)染miR-638inhibitor的細(xì)胞株，表達(dá)水平下調(diào)，與Negative Co

16、ntrol比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-638mimics的細(xì)胞，VEGFAmRNA和蛋白表達(dá)水平下降，較Negative Control組有明顯差異，而轉(zhuǎn)染miR-638inhibitor的細(xì)胞VEGFAmRNA和蛋白表達(dá)水平與Negative Control組相比較，無明顯差異。
　　3.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)VEGFA-3'UTR野生型報(bào)告質(zhì)粒與miR-638共轉(zhuǎn)染，熒光素酶活性較對(duì)照組及突變組比較明顯下降，

17、而突變型VEGFA-3'UTR報(bào)告質(zhì)粒與miR-638共轉(zhuǎn)染，熒光素酶活性與對(duì)照組相比，無明顯差異。此結(jié)果證實(shí)，VEGFAmRNA的3'UTR端是miR-638的直接作用靶點(diǎn)，miR-638通過靶向VEGFA-3'UTR調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)，進(jìn)而以揮其對(duì)血管生成的調(diào)控作用。
　　4.應(yīng)用Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，觀察miR-638轉(zhuǎn)染后的白血病細(xì)胞系K562、HL60對(duì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響，并用MTT法檢測HUVECs的增殖能力。

18、結(jié)果顯示，K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-638mimcs組紫外光吸光度值(OD)較miR-638 inhibitor組及對(duì)照組明顯減低，miR-638 inhibitor組較對(duì)照組比較無明顯差異;HL60細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-638mimcs組OD值較miR-638 inhibitor組及對(duì)照組明顯減低，miR-638inhibitor組較對(duì)照組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究結(jié)論：
　　骨髓血管新生是急性髓系白血病重要的病理過程，骨