擬南芥miR393通過與ABA信號途徑互作調(diào)控種子成熟和萌發(fā)的機制研究.pdf

1、種子的休眠和萌發(fā)是植物生命周期中兩個重要的階段，同時也是影響作物生產(chǎn)的農(nóng)藝性狀。有研究表明，除了通過ABA和GA在種子中的平衡調(diào)控休眠和萌發(fā)之外，生長素也發(fā)揮了調(diào)控功能。miR393是植物中最為保守的miRNA家族之一，在擬南芥中其靶基因編碼生長素受體F-box蛋白TIR1/AFB家族(theTIR1/AFB Auxin Receptor，TAAR)。我們的前期數(shù)據(jù)顯示，miR393表達受到ABA調(diào)控，其靶基因調(diào)控種子萌發(fā)對ABA的敏感

2、性，但miR393是否參與影響種子成熟和萌發(fā)及相關機制目前仍知之甚少。
　　本研究以擬南芥miR393及其靶基因的各種報告株系及突變體為材料，探究miR393如何通過靶基因TIR1及相關激素信號途徑參與調(diào)控擬南芥種子的成熟和萌發(fā)，獲得了以下主要結果:
　　1、擬南芥種子成熟和萌發(fā)過程miR393及其靶基因的表達模式
　　1.1、種子成熟和萌發(fā)過程miR393及其靶基因的組織特異性表達模式
　　采用MIR393 a

3、/b啟動子報告株系pMIR393a/b:G US，突變型和野生型靶蛋白報告株系p TIR1:mTIR1-G US，pTIR1:cTIR1-GUS和生長素反應報告株系DR5:GUS，對擬南芥不同時期莢果和吸脹的種子進行GUS染色。結果顯示，MIR393b在種子成熟中期(StageⅢ)轉錄增強，在后期StageⅣ表達減弱;MIR393a的轉錄在所檢測的幾個時期變化不顯著。cTIR1蛋白的表達在StageⅠ至stageⅢ受到明顯的轉錄后抑制，

4、而DR5表示的生長素反應信號在成熟早期（StageⅠ-StageⅢ）較強，至成熟后期GUS信號減弱。
　　在種子吸脹過程中，miR393的表達有上升趨勢，pMIR393a的轉錄集中在子葉和胚根，pMIR393b則主要在子葉中轉錄，miR393的積累與DR5:GUS表達的位點相互重合; CTIR1在于種子和吸脹種子中均有表達，隨萌發(fā)進行有增強的趨勢，表達位點包括子葉近軸端和胚根延長區(qū)，根尖無表達;而不受miR393調(diào)控的突變版本mT

5、IR1蛋白表達范圍更廣，GUS陽性部位擴散至根尖，說明TIR1蛋白的積累受到miR393的抑制;TIR1蛋白積累的位點與DR5:GUS表達的位點在子葉中重合，在胚根中相斥。這些數(shù)據(jù)暗示miR393介導的轉錄后調(diào)控，對于種子成熟和萌發(fā)過程TIR1的空間分布及生長素反應有一定的調(diào)控作用。
　　1.2、在種子成熟和萌發(fā)過程中miR393及其靶基因表達水平的變化
　　用野生型Col.0作為材料，對種子成熟和萌發(fā)過程中的miR393及

6、其靶基因進行定量RT-PCR檢測。結果顯示，在種子成熟過程中，miR393前體pri-MIR393b的表達水平先升后降，靶基因TIR1，AFB2和AFB3表達呈下調(diào)趨勢，說明在種子成熟后期，miR393及其靶基因逐步關閉功能;在種子吸脹過程中，隨著種子開始萌發(fā)，miR393及其靶基因的表達均明顯上調(diào)。說明在種子成熟和萌發(fā)過程中，miR393的豐度與生長素反應密切相關，其靶基因轉錄本的水平受到多種因素的影響。
　　2、擬南芥miR3

7、93通過與ABA途徑互作調(diào)控種子休眠
　　2.1、ABA處理影響miR393表達
　　用5μM ABA處理擬南芥Col.0種子1天，定量RT-PCR的結果顯示:ABA處理后，miR393和靶基因的表達均下調(diào)，說明ABA負調(diào)控miR393的表達。
　　2.2、miR393影響種子的初生休眠
　　以擬南芥野生型Col.0，miR393功能缺失突變體mir393ab，靶基因過量表達轉基因純合株系35S:m TIR1，m

8、iR393功能抑制株系35S:MIM393作為實驗材料，統(tǒng)計將剛收獲種子的萌發(fā)率和出綠率。結果發(fā)現(xiàn):與野生型相比，35S:mTIR1和35S:MIM393株系的萌發(fā)率顯著低于野生型。這說明miR393可能通過TIR1負調(diào)控種子的初生休眠。
　　2.3、miR393影響種子萌發(fā)和幼苗生長對ABA的敏感性
　　在合有不同濃度ABA的培養(yǎng)基中萌發(fā)種子，統(tǒng)計萌發(fā)率、出綠率和根伸長對ABA的敏感性。結果顯示，與野生型相比，3個突變體株

9、系mir393ab，35S:m TIR1和35S:MIM393的萌發(fā)率和出綠率均有顯著降低，而35S:mTIR1根伸長顯著降低，從而說明miR393負調(diào)控種子萌發(fā)和幼苗生長對ABA的敏感性。
　　2.4、miR393對種子成熟和萌發(fā)過程生長素和ABA信號相關基因表達的影響
　　以擬南芥擬南芥野生型Col.0，35S:MIR393a，mir393ab，35S:mTIR1為材料，對種子成熟和萌發(fā)過程，生長素和ABA信號相關的基因

10、表達進行了qRT-PCR檢測。對生長素信號相關基因ARF10的qRT-PCR檢測顯示:在種子成熟過程中，ARF10轉錄本水平呈先升后降的趨勢，在35S:mTIR1株系中ARF10在StageⅢ顯著增加，說明TIR1水平的提高，促進這一時期ARF10的表達。在萌發(fā)期，ARF加轉錄本水平逐漸上升，在35S:mTIR1和mir393ab株系的干種子(DS)中，ARF10的轉錄水平顯著低于野生型，但在萌發(fā)過程中，ARF10表達水平顯著上升，上調(diào)

11、幅度較大。
　　對ABA信號通路相關基因的qRT-PCR檢測顯示:在成熟中后期mir393ab突變體中ABI3和ABI4水平顯著高于野生型，在吸脹萌發(fā)后期(DAC1)35S:mTIR1突變體中ABI3和ABI4顯著高于野生型，暗示miR393可能通過TIR1調(diào)控種子成熟和萌發(fā)期ABI3和ABI4的表達水平。
　　總之，在種子成熟和萌發(fā)過程中，miR393通過自身的特異表達，抑制其靶基因TIR1的水平及空間分布，負調(diào)控種子的初