miR-455通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白途徑對(duì)短期和長期壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響.pdf

1、背景:流行病學(xué)分析顯示當(dāng)今社會(huì)導(dǎo)致死亡的主要疾病主要為高血壓，冠心病等心血管疾病，但隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)與研究手段的發(fā)展，這方面的救治成功率得到了明顯提高。雖然心血管病的致死率逐年降低，但它們最終的轉(zhuǎn)歸即慢性心力衰竭卻呈現(xiàn)日益增加，因此救治慢性心力衰竭成為防治的重點(diǎn)。慢性心衰出現(xiàn)后心肌功能多受損，原因各有不同。慢心衰前期多會(huì)出現(xiàn)心肌肥厚，心肌肥厚又是導(dǎo)致慢性心衰的重要原因之一，二者互為因果。
　　近年來在多種生命體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的小分子R

2、NA，microRNAs，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的活性，更進(jìn)一步又發(fā)現(xiàn)很多microRNAs與心肌肥厚密切相關(guān)。microRNAs若要發(fā)揮生物學(xué)的功能，它的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須經(jīng)過多次酶剪切加工后形成成熟的microRNAs。過程如下最初的microRNAs經(jīng)過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄后，首先形成初始microRNAs(Pri-microRNAs)，再經(jīng)Drosha剪切，變成前體rnicroRNAs(Pre-microRNAs)，有其特有的發(fā)卡結(jié)構(gòu);Pr

3、e-microRNAs從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿，此過程由Exportin-5參與，在胞漿中被Dicer酶剪切，形成雙鏈microRNAs分子;最后，雙鏈microRNAs分離，只有一條成為成熟的microRNAs，再與別的分子一起形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，RISC再通過與mRNA的3'端非編碼區(qū)相互作用，引起靶基因mRNA的降解或者翻譯抑制，就是前面所講在轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。rnicroRNAs通過轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)節(jié)目的蛋白質(zhì)

4、參與許多心血管疾病。
　　我們通過升主動(dòng)脈縮窄(transverse aorta constriction，TAC)對(duì)小鼠進(jìn)行短期與長期的壓力負(fù)荷，建立了心肌肥厚與心力衰竭的模型，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行miR-455的上調(diào)，旨在探討miR-455在壓力負(fù)荷心肌肥厚中的細(xì)胞與分子學(xué)機(jī)制，為預(yù)防與治療心肌肥厚提供新的思路。
　　第一部分 miR-455通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白促進(jìn)短期壓力負(fù)荷心肌肥厚的心肌細(xì)胞肥大
　　目的:最近研究顯

5、示，microRNAs與多種心血管疾病有關(guān)，但是迄今為止并沒有miRNA-455(miR-455)與心肌肥厚的研究。我們通過小鼠升主動(dòng)脈縮窄(transverse aorta constriction，TAC)2周建立了心肌肥厚的模型，旨在探討miR-455在心肌肥厚中細(xì)胞與分子學(xué)機(jī)制。
　　方法:選用18只昆明種小鼠，隨機(jī)分為手術(shù)結(jié)扎（升主動(dòng)脈縮窄）+miR-455為實(shí)驗(yàn)組(TAC.miR-455，尾靜脈注射包被miR-455的

6、腺病毒)，手術(shù)結(jié)扎+GFP為陰性對(duì)照組(TAC.GFP，尾靜脈注射包被綠色熒光蛋白的腺病毒)和假手術(shù)組(Sham，尾靜脈注射包被綠色熒光蛋白的腺病毒)。術(shù)后2周測(cè)量小鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲數(shù)據(jù);對(duì)心肌組織進(jìn)行HE和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化;應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)肥大基因與纖維化基因的表達(dá);Westem blot分析凋亡蛋白;qRT-PCR與Western blot分析miR-455的靶基因和蛋白。
　　結(jié)果:

7、　　1、miR-455在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染
　　在尾靜脈注射GFP的TAC后2周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的降低，而經(jīng)過尾靜脈注射miR-455前體的TAC后2周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的升高，TAC.GFP組與Sham組相比較，TAC.miR-455組與TAC.GFP組相比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。
　　2、miR-455對(duì)TAC后2周小鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲和組織病理學(xué)的影響
　　2周時(shí)，經(jīng)右側(cè)頸

8、動(dòng)脈測(cè)壓顯示，同Sham組比較，TAC小鼠BP和LVESP明顯升高，其差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是同Sham組比較，TAC2周時(shí)LVEDP無明顯變化。2周時(shí)，TAC.GFP組與Sham組比較，心肌細(xì)胞橫截面積增大，心重體重比增加，LVAWd明顯增加，LVIDd變小，EF增加，其差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些指標(biāo)在TAC.miR-455組有了進(jìn)一步的發(fā)展(P＜0.05），如心肌細(xì)胞橫截面積進(jìn)一步增大，心重體重比，LVAWd，EF增加，L

9、VIDd變小，但EF值2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　3、miR-455對(duì)心肌肥厚基因的影響
　　我們?cè)u(píng)估了基因轉(zhuǎn)染后心肌肥厚基因Anf, Acta1和Myh7的表達(dá)。2周時(shí)和Sham組相比較，TAC.GFP組小鼠心肌組織中Anf, Acta1和Myh7有明顯增加(P＜0.01），而且在TAC.miR-455組，Anf, Acta1和Myh7的表達(dá)有進(jìn)一步增加(P＜0.01)。
　　4、miR-455對(duì)心肌纖維

10、化的影響
　　2周時(shí)通過Masson染色，Sham組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細(xì)胞間隙中，呈現(xiàn)藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色，我們觀察到TAC.GFP組和TAC.miR-455組較之于Sham組心肌膠原纖維明顯增加，但2者相比差異不明顯。對(duì)于代表心肌纖維化的基因Tgfβ1和Ctgf，較之于Sham組，在TAC.GFP組和TAC.miR-455組的表達(dá)都有明顯上升(P＜0.05），但2者比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　5、mi

11、R-455對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　Western blot示2周時(shí)TAC.GFP組促凋亡蛋白Bax有明顯上升，TAC.miR-455組變化不明顯(P＜0.05)。TAC.GFP組和TAC.miR-455組抗凋亡蛋白Bcl-2有所下降，但兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　6、在TAC導(dǎo)致的心肌肥厚中鈣網(wǎng)蛋白是miR-455的target gene
　　我們進(jìn)行了Calr和GRP78基因與蛋白的檢測(cè)，Weste

12、rn blot分析，TAC.GFP組Calr和GRP78升高，但經(jīng)過了miR-455的干擾，GRP78依然升高，而Calr卻有了明顯下降，說明Calr是miR-455的target gene之一。PCR示Calr下降同時(shí)也有Calr mRNA的下降，說明miR-455對(duì)Calr的調(diào)節(jié)是通過降低mRNA來抑制蛋白翻譯。
　　小結(jié):短期壓力負(fù)荷后小鼠出現(xiàn)了代償性心肌肥厚的特征，表現(xiàn)為心室壁的增厚，心室腔的縮小以及心臟收縮功能的增強(qiáng)，出

13、現(xiàn)明顯心肌細(xì)胞增大，病理學(xué)出現(xiàn)明顯心肌細(xì)胞增大。伴隨出現(xiàn)胎兒基因的重新激活。miR-455通過降解靶mRNA，Calr降低這條途徑，使得心肌細(xì)胞進(jìn)一步增大，心肌肥厚更加明顯。
　　第二部分 miR-455通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白減輕長期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠的心肌纖維化和心肌凋亡
　　目的:心肌肥厚出現(xiàn)后，左心室重構(gòu)進(jìn)行性進(jìn)展，會(huì)導(dǎo)致猝死、心力衰竭、心律失常等嚴(yán)重心臟事件。左室重構(gòu)主要表現(xiàn)為:心肌細(xì)胞肥大、心肌凋亡增加、非心肌細(xì)胞（成

14、肌纖維細(xì)胞），非細(xì)胞成分（膠原纖維）增加和心肌電生理以及代謝異常。我們構(gòu)建了TAC后4周心力衰竭的小鼠，同時(shí)用miR-455進(jìn)行干擾，以期了解miR-455對(duì)心肌纖維化和細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)影響及機(jī)制。
　　方法:本研究建立了TAC4周后的小鼠模型，并對(duì)miR-455進(jìn)行于擾，測(cè)量小鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲數(shù)據(jù)，對(duì)心肌組織進(jìn)行HE和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化;應(yīng)用PCR方法檢測(cè)肥大基因與纖維化基因;TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，

15、Westem blot分析凋亡蛋白;PCR與Western blot分析miR-455的target gene與蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、miR-455在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染
　　在尾靜脈注射GFP的TAC后4周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的降低，而經(jīng)過尾靜脈注射miR-455前體的TAC后4周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的升高，TAC.GFP組與Sham組相比較，TAC.miR-455組與TAC.GFP組相比較，

16、均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。
　　2、miR-455對(duì)TAC后4周小鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲的影響
　　在TAC后的4周，與TAC后2周比較，雖然BP，LVESP,心重體重比及心肌細(xì)胞橫截面積無明顯變化，但觀察到LVEDP增高，LVAWd變薄，LVIDd變大，EF下降(P＜0.05），說明這些小鼠發(fā)生了明顯的心肌重塑。但在TAC.miR-455組雖然LVAWd有所變?。≒＜0.05），但LVIDd并未見到明顯的擴(kuò)大(P

17、＞0.05），EF也無明顯下降，也就是說，經(jīng)過miR-455干擾的小鼠心肌依然保持著心肌肥厚的狀態(tài)。這些結(jié)果暗示出miR-455可以阻止TAC4周后的心肌重塑。
　　3、miR-455對(duì)心肌肥厚基因的影響
　　4周時(shí)，和Sham組相比較，TAC.GFP組和TAC.miR-455組小鼠心肌組織中Anf, Acta1和Myh7有進(jìn)行性上升（P＜0.05），但有一個(gè)現(xiàn)象值得注意，Myh7的表達(dá)在TAC.GFP組超過了TAC.miR

18、-455組(P＜0.01)。
　　4、miR-455對(duì)心肌纖維化的影響
　　心肌組織切片Masson染色顯示:Sham組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細(xì)胞間隙中，呈現(xiàn)藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色;TAC.GFP組較之于Sham組心肌膠原纖維明顯增加，而TAC.miR-455組較之于TAC.GFP組心肌膠原纖維卻有顯著地減少。對(duì)于代表心肌纖維化的基因Tgfβ1和Ctgf，雖然較之于Sham組，在TAC.GFP組和TAC.miR-455

19、組的表達(dá)都有明顯上升，但在4周時(shí)，Tgf1和Ctgf在TAC.miR-455組的表達(dá)要低于在TAC.GFP組的表達(dá)（P＜0.01）。說明miR-455可以減輕TAC4周后的心肌重塑。
　　5、miR-455抑制心肌細(xì)胞凋亡
　　經(jīng)過TUNEL染色，TAC.GFP組凋亡細(xì)胞明顯增多，而TAC.miR-455組凋亡細(xì)胞較之于TAC.GFP組有明顯下降。通過Western blot分析，我們檢測(cè)了抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白B

20、ax，結(jié)果顯示，TAC.miR-455組較之于TAC.GFP組抗凋亡蛋白Bcl-2有顯著上升，促凋亡蛋白Bax有明顯下降。
　　6、在TAC導(dǎo)致的心肌肥厚中鈣網(wǎng)蛋白是miR-455的target gene
　　我們進(jìn)行了Calr和GRP78基因與蛋白的檢測(cè)，Western blot分析，TAC.GFP組Calr和GRP78升高，但經(jīng)過了miR-455的干擾，GRP78依然升高，而Calr卻有了明顯下降，說明Calr是miR-

21、455的target gene之一。PCR示Calr下降同時(shí)也有Calr mRNA的下降，說明miR-455對(duì)Calr的調(diào)節(jié)是通過降低mRNA來抑制蛋白翻譯。
　　小結(jié):長期壓力負(fù)荷后小鼠出現(xiàn)了失代償心衰的特征，表現(xiàn)為左室舒張末期壓力的明顯增高，因?yàn)樾氖仪怀霈F(xiàn)擴(kuò)大影響了心臟收縮功能，左室射血分?jǐn)?shù)降低，出現(xiàn)明顯心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)伴隨纖維化基因與凋亡蛋白的改變。若長期上調(diào)miR-455，會(huì)降解靶rnRNA，使Calr降低，

22、會(huì)減輕心肌纖維化及凋亡，減緩了心力衰竭的進(jìn)程。
　　結(jié)論:在本研究中我們得到以下結(jié)論:
　　短期壓力負(fù)荷后小鼠出現(xiàn)了代償性心肌肥厚的特征，表現(xiàn)為心室壁的增厚，心室腔的縮小以及心臟收縮功能的增強(qiáng)，病理學(xué)出現(xiàn)明顯心肌細(xì)胞增大。伴隨出現(xiàn)胎兒基因的重新激活。miR-455通過降解靶mRNA，Calr降低這條途徑，使得心肌細(xì)胞進(jìn)一步增大，心肌肥厚更加明顯。我們可以通過對(duì)miR-455進(jìn)行調(diào)節(jié)來減輕心肌肥厚。
　　長期壓力負(fù)荷后小