Tomoregulin-1通過(guò)TAK1-JNK信號(hào)通路抑制壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚.pdf

1、第一部分Tomoregulin-1通過(guò)TAK1-JNK信號(hào)通路抑制壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚
　　背景: 肥厚型心肌病是一類(lèi)以左心室和/或右心室肥厚為主要特征的可遺傳的心肌疾病，是誘發(fā)猝死、心力衰竭和中風(fēng)的重要危險(xiǎn)因素之一?，F(xiàn)階段，關(guān)于肥厚型心肌病的分子病理生理的基礎(chǔ)研究仍較少，確定參與肥厚型心肌病病理發(fā)生發(fā)展的重要修飾基因?qū)﹂_(kāi)展肥厚型心肌病新的治療方法至關(guān)重要。Tomoregulin-1是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)生長(zhǎng)因子，主要參與胚胎中后期發(fā)

2、育的調(diào)控和成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持，在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表達(dá)異常。Tomoregulin-1在心臟組織中亦表達(dá)，并能夠和參與心臟發(fā)育的Cripto相結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)室基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tomoregulin-1在遺傳性肥厚型心肌病cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟組織中表達(dá)增高。但目前尚無(wú)有關(guān)Tomoregulin-1在心臟中的功能，尤其是在肥厚型心肌病中的功能研究。因此，本文旨在通過(guò)建立Tomoregulin-1沉默和Tomore

3、gulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，分析Tomoregulin-1對(duì)肥厚型心肌病的調(diào)節(jié)作用及可能的分子機(jī)制。
　　方法: (1) Tomoregulin-1于野生型和肥厚型心肌病小鼠心臟組織中的定位和表達(dá):免疫熒光觀察Tomoregulin-1于野生型C57BL/6J小鼠心臟組織中的定位;Westernblot檢測(cè)Tomoregulin-1于野生型C57BL/6J小鼠心臟組織中的時(shí)程表達(dá)變化和Tomoregulin-1于遺傳性肥厚型心

4、肌?。╟TnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠）及壓力負(fù)荷致肥厚型心肌病（主動(dòng)脈縮窄，thoracic aorta constriction，TAC）小鼠心臟組織中的表達(dá)變化。
　　(2)心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠的建立:分別將靶向Tomoregulin-1基因的siRNA和鼠源Tomoregulin-1基因插入α-MHC啟動(dòng)子下游，構(gòu)建表達(dá)載體，通

5、過(guò)顯微注射法建立心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠。PCR鑒定Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型，Western blot檢測(cè)Tomoregulin-1的表達(dá)，分別篩選Tomoregulin-1沉默和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因首建鼠進(jìn)行繁殖培育，穩(wěn)定傳代后，子代小鼠用于本文實(shí)驗(yàn)。

6、　　(3)正常生理情況下，心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠心臟形態(tài)和功能的表型分析:M型超聲心動(dòng)圖于1、3、5和7月齡檢測(cè)同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠正常生理情況下心臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能。
　　(4)壓力負(fù)荷刺激情況下，心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠

7、和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠的表型分析與分子機(jī)制探究:于8-10周齡，分別對(duì)同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行TAC，同時(shí)設(shè)假手術(shù)對(duì)照組（sham組）。于術(shù)后4周，記錄sham和TAC組中同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的生存狀況，M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能變化，計(jì)算心

8、臟重量與體重的比值評(píng)價(jià)心肌肥厚程度，病理組織學(xué)染色觀察小鼠心臟組織學(xué)改變，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)反映心肌間質(zhì)膠原成分的Ⅲ型膠原α1（Col3α1）的表達(dá)變化。Westemblot檢測(cè)sham和TAC組中同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2型受體（TGFβ type2 receptor，TβR2）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1型受體（TGFβ type1 receptor，

9、TβR2）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活激酶1（TGFβ-activated kinase1，TAK1）和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase，JNK)等與心肌肥厚相關(guān)的因子的表達(dá)變化。
　　結(jié)果: (1) Tomoregulin-1定位于野生型小鼠的心肌細(xì)胞而非心臟成纖維細(xì)胞。隨著年齡的增加，Tomoregulin-1在野生型小鼠心臟組織中表達(dá)水平逐漸增高;且在遺傳性（cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠）及壓力負(fù)荷(

10、TAC)致肥厚型心肌病小鼠模型心臟組織中表達(dá)增高。
　　(2)分別建立了2個(gè)系的心臟組織特異的Tomoregulin-1低表達(dá)沉默小鼠和Tomoregulin-1高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　(3)正常生理情況下，M型超聲心動(dòng)圖顯示，與同窩陰性小鼠相比，心臟組織特異Tomoregulin-1沉默小鼠在1、3、5和7月齡時(shí)心臟均呈現(xiàn)室壁變薄，心腔增大，心收縮功能減退的表型;心臟組織特異Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠在5月

11、齡之前心臟均呈現(xiàn)室壁增厚，心腔縮小，心收縮功能增強(qiáng)的表型，在5月齡之后，與同窩陰性小鼠相比，Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠心臟室壁增厚不明顯。
　　(4)壓力負(fù)荷刺激情況下，生存率分析顯示，sham組的同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率均為100％; TAC組，與同窩陰性小鼠相比，Tomoregulin-1沉默小鼠的術(shù)后4周生存率顯著降低，僅為66.7％

12、，而Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率為84.6％，顯著高于同窩陰性小鼠。M型超聲心動(dòng)圖顯示，Tomoregulin-1沉默小鼠因壓力負(fù)荷致心臟室壁增厚程度顯著高于同窩陰性小鼠，而Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠心臟室壁增厚得到明顯改善。同時(shí)，因代償增加的心收縮功能亦顯著低于同窩陰性小鼠。與同窩陰性小鼠相比，Tomoregulin-1沉默小鼠因壓力負(fù)荷致心臟重量與體重的比值顯著升高，而Tomoregulin-1

13、過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠心肌肥厚程度顯著減少。病理組織學(xué)染色可見(jiàn) Tomoregulin-1沉默小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂和間質(zhì)纖維化程度均顯著高于同窩陰性小鼠，而過(guò)表達(dá)Tomoregulin-1顯著改善了壓力負(fù)荷導(dǎo)致的病理組織學(xué)改變。反映心肌間質(zhì)膠原成分的Col3α1在Tomoregulin-1沉默小鼠中的表達(dá)顯著增加，Col3α1的病理性增加在Tomoregulin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠中得到抑制。與心肌肥厚相關(guān)的TβR1、TAK1和JNK在Tom

14、oregulin-1沉默小鼠心臟組織中均被激活，且經(jīng)過(guò)壓力負(fù)荷病理刺激后，激活程度更加明顯;而過(guò)表達(dá)Tomoregulin-1在生理和病理情況下均可顯著抑制TβR1、TAK1和JNK的激活。
　　結(jié)論: 過(guò)表達(dá)Tomoregulin-1可顯著改善壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚，降低Tomoregulin-1的表達(dá)可加速心肌肥厚的病理進(jìn)程;心肌細(xì)胞中的TAK1-JNK信號(hào)通路參與Tomoregulin-1對(duì)壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚的保護(hù)性調(diào)節(jié)

15、過(guò)程。Tomoregulin-1可能是肥厚型心肌病調(diào)節(jié)的重要修飾基因，為臨床肥厚型心肌病的治療提供新的研究思路和方向。
　　第二部分利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立的瘦素受體基因敲除大鼠表型的系統(tǒng)分析
　　背景: 隨著人們生活水平的提高，物質(zhì)條件的改善，全球肥胖的患病率和發(fā)生率迅速增加，肥胖已成為全球性流行病。肥胖能引起甚多疾病，如2型糖尿病、高膽固醇血癥、高血壓或心臟病，與死亡率的增加和平均壽命的減少直接相關(guān)。人類(lèi)基因組

16、計(jì)劃的完成，大量與肥胖、糖尿病等疾病相關(guān)的基因陸續(xù)被人們發(fā)現(xiàn)，瘦素受體(leptin receptor, Lepr)便是其中之一。Lepr由糖尿病(diabetes，db)基因編碼，于脈絡(luò)叢中高表達(dá)。Lepr與其配體leptin結(jié)合啟動(dòng)調(diào)節(jié)攝食和機(jī)體的能量平衡。Lepr缺失或leptin缺失，均會(huì)導(dǎo)致肥胖的發(fā)生，并出現(xiàn)不同程度糖尿病臨床表現(xiàn)。目前，已有多種Lepr基因相關(guān)的嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型應(yīng)用于肥胖、糖尿病的研究，但現(xiàn)階段的動(dòng)物模型均存在

17、一定的不足，如Lepr缺失的小鼠（db/db小鼠，C57BL/6J背景）表現(xiàn)出一過(guò)性高血糖，Lepr缺失的大鼠(Zucker大鼠，a/fa大鼠)葡萄糖耐受受損表型出現(xiàn)遲緩等，不能完全復(fù)制人類(lèi)糖尿病的所有臨床表現(xiàn)。所以，建立更理想的肥胖、糖尿病等代謝疾病的動(dòng)物模型，對(duì)防治藥物的研發(fā)具有重大的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。
　　方法: 利用常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)系列叢集關(guān)聯(lián)蛋白9技術(shù)(clustered regularly inte

18、rspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated9,CRISPR/Cas9)建立Lepr基因敲除大鼠:針對(duì)Lepr基因第四個(gè)外顯子設(shè)計(jì)并合成兩個(gè)寡聚核苷酸鏈，構(gòu)建gRNA表達(dá)載體，將體外轉(zhuǎn)錄好的Cas9 mRNA(20ng/μl)和gRNA(每個(gè)gRNA10ng/μl)的混合物通過(guò)顯微注射法注入Sprague Dawley(SD)大鼠受精卵中，共產(chǎn)生8只大鼠。PCR鑒定Lepr基因

19、敲除大鼠的基因型，TA克隆、測(cè)序進(jìn)一步檢測(cè)確定Lepr敲除情況，Western blot檢測(cè)LEPR的表達(dá)，篩選Lepr基因敲除首建鼠進(jìn)行繁殖培育，穩(wěn)定傳代后，子代的大鼠用于本文實(shí)驗(yàn)。于1-8月齡分別檢測(cè)雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr基因敲除純合子（Lepr-/-）大鼠體重、平均攝食量、空腹血糖和隨機(jī)血糖。于2、4和8月齡分別對(duì)雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠進(jìn)行腹腔葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，同時(shí)測(cè)定葡萄糖刺激下的胰島素水平。于2、4

20、和8月齡分別對(duì)雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠進(jìn)行血生化指標(biāo)測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)為:甘油三酯、總膽固醇、高密度膽固醇和低密度膽固醇。病理組織學(xué)染色觀察2、4和8月齡同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠胰臟、肝臟、腎臟和脂肪組織的組織學(xué)改變。微型計(jì)算機(jī)斷層掃描分析8月齡同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠的股骨遠(yuǎn)端骨小梁結(jié)構(gòu)和骨結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)，如骨體積/全部組織體積、骨小梁的數(shù)量、骨小梁間隙、骨小梁硬度和骨密度。
　　結(jié)果: 利用CRIS

21、PR/Cas9技術(shù)，通過(guò)顯微注射法共產(chǎn)生8只大鼠。經(jīng)PCR鑒定、TA克隆和測(cè)序分析后，篩選出Lepr基因敲除298個(gè)堿基、插入4個(gè)堿基的2號(hào)大鼠作為首建鼠進(jìn)行繁殖培育。Western blot檢測(cè)Lepr-/-大鼠肝臟中無(wú)LEPR表達(dá)。Lepr-/-大鼠于1月齡出現(xiàn)嚴(yán)重的早期肥胖，至8月齡時(shí)，雄性和雌性L(fǎng)epr-/-大鼠的體重分別是同窩陰性大鼠的1.6倍和2.6倍;體重的增加伴隨著攝食量的顯著增加。雄性L(fǎng)epr-/-大鼠于4月齡出現(xiàn)空腹

22、血糖增高，并持續(xù)至8月齡;于2月齡出現(xiàn)隨機(jī)血糖增高，于4月齡達(dá)到峰值，是同窩陰性大鼠隨機(jī)血糖值的2.64倍;雌性L(fǎng)epr-/-大鼠的空腹血糖和隨機(jī)血糖值均近乎正常水平。雄性L(fǎng)epr-/-大鼠于2月齡出現(xiàn)明顯的葡萄糖耐受受損，隨年齡增大，受損程度逐漸增加，直至8月齡;雌性L(fǎng)epr-/-大鼠僅于4月齡出現(xiàn)明顯的葡萄糖耐受受損。雄性和雌性L(fǎng)epr-/-大鼠于2、4和8月齡均出現(xiàn)高胰島素血癥、高膽固醇血癥等脂質(zhì)代謝紊亂。病理組織學(xué)染色顯示，與同

23、窩陰性大鼠相比，Lepr-/-大鼠胰島出現(xiàn)明顯的空泡、肥大、纖維化和出血;嚴(yán)重的肝臟脂肪變性;脂肪細(xì)胞體積顯著增大;腎小球基質(zhì)擴(kuò)張，部分腎小球硬化，腎小管擴(kuò)張和再生。8月齡的Lepr-/-大鼠，與同窩陰性大鼠相比，其股骨遠(yuǎn)端的骨體積/全部組織體積顯著減小，骨小梁數(shù)量顯著減少，骨小梁間隙顯著增加，骨密度顯著減小。
　　結(jié)論: 利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立Lepr基因敲除大鼠，并表現(xiàn)出明顯的肥胖、食欲過(guò)盛、血糖升高、葡萄糖耐