miR-638靶向抑制MAPK14表達(dá)調(diào)控BCG與巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng).pdf

1、目的：研究microRNA-638通過調(diào)節(jié)MAPK14的表達(dá)，參與BCG引起的炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：⑴通過miRanda、Targetscan和PicTar等靶基因預(yù)測軟件對microRNA-638（miR-638）可能的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示，與固有免疫應(yīng)答關(guān)系密切的 MAPK14是理想的研究靶基因，本課題擬將MAPK14的3＇UTR構(gòu)建到pMIR-Report表達(dá)載體中，同時(shí)應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將過表達(dá)m

2、iR-638及抑制miR-638表達(dá)的質(zhì)粒分別與pMIR-Report-MAPK14重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，以海腎熒光素酶作為參照，進(jìn)行熒光素酶檢測，以此驗(yàn)證miR-638與MAPK14之間的靶向作用關(guān)系。⑵根據(jù)最新miRBase數(shù)據(jù)庫人源miR-638（miRBaseNO:MI0003653）的基因序列，化學(xué)合成含有miR-638成熟序列的短發(fā)夾RNA（small hairpin RNA，shRNA

3、），并構(gòu)建入穿梭載體pSicoR質(zhì)粒中，經(jīng)雙酶切及測序鑒定，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒與pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.91兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，包裝過表達(dá)miR-638的慢病毒，并測定病毒滴度；另外合成miR-638 inhibitors(23 nt2’-甲氧修飾的RNA寡核酸，能有效抑制成熟miR-638的表達(dá))。⑶將包裝成功的LV-miR-638慢病毒及miR-638 inhibitors分別侵染TH

4、P-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的巨噬細(xì)胞，24h后再應(yīng)用BCG刺激細(xì)胞12h，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液，提取microRNAs、mRNA和全蛋白，應(yīng)用Real-Time PCR檢測miR-638表達(dá)水平及MAPK14的mRNA的表達(dá)水平，應(yīng)用Western Blot檢測MAPK14蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞上清液的細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-12的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測，最終我們選定了在 p38M

5、APK信號通路中發(fā)揮重要作用的 MAPK14作為研究的靶基因。通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)了miR-638可以靶向結(jié)合MAPK143’UTR的作用位點(diǎn)并抑制其表達(dá)；轉(zhuǎn)染了pSicoR-miR-638過表達(dá)載體組，MAPK14的相對熒光素酶活性與突變體的活性相比下降約5.5倍(P<0.05)，與正常對照組相比下降約6.1倍(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染了miR-638 inhibitor組，MAPK14的熒光素酶活性與突變體的活性相比有所升高

6、，與pSicoR-miR-638過表達(dá)載體組相比升高約6.6倍(P<0.05)。②成功構(gòu)建了pSicoR-miR-638慢病毒表達(dá)載體，并成功包裝慢病毒以及病毒滴度的測定，測定結(jié)果顯示病毒滴度達(dá)1x106TU/mL。③miR-638表達(dá)量的檢測結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染重組載體pSicoR-miR-638后miR-638表達(dá)上調(diào)31.2倍（p＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-638 inhibitors后 miR-638表達(dá)量與正常對照組相比下調(diào)20.2倍

7、（p＜0.05）。結(jié)果表明pSicoR-miR-638重組慢病毒可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)成熟的miR-638，從而顯著上調(diào)miR-638的表達(dá)水平；miR-638 inhibitors可以抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-638的表達(dá)。MAPK14 mRNA Real-Time PCR結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-638后MAPK14 mRNA的表達(dá)水平較正常對照組相比下調(diào)50.1倍（p＜0.05）；抑制miR-638表達(dá)后MAPK14 mRNA的表達(dá)水平

8、較正常對照組相比有所上調(diào)。Western blot分析結(jié)果顯示：pSicoR-miR-638重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，MAPK14蛋白表達(dá)量較正常組明顯降低，抑制 miR-638表達(dá)后 MAPK14蛋白質(zhì)表達(dá)量增加，而 BCG刺激三組細(xì)胞后MAPK14的蛋白表達(dá)量都有所增加。通過ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-12的表達(dá)，來觀察 miR-638對 MAPK14的下游細(xì)胞因子的影響，評價(jià) miR-638對p38MAPK信號通路炎性反應(yīng)

9、的調(diào)控。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pSicoR/miR-638后巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-12的蛋白表達(dá)顯著性降低，而轉(zhuǎn)染miR-638 inhibitors后巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-12的蛋白表達(dá)顯著性升高。這些結(jié)果表明 miR-638可以通過靶向作用MAPK14的表達(dá)，影響下游細(xì)胞因子的表達(dá)，在 p38MAPK信號通路中起到負(fù)向調(diào)控作用。
　　結(jié)論：⑴成功包裝了高滴度的、可過表達(dá)miR-638的慢病毒顆粒，并證實(shí)m