靶向調(diào)控IFITM5基因的miR-762抑制Saos-2細(xì)胞礦化的研究.pdf

1、干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白5(interferon induced transmembrane protein5，IFITM5)是干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族成員之一，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的作用。在成骨細(xì)胞分化階段表達(dá)量增加，尤其是骨基質(zhì)形成期和礦化階段達(dá)到峰值。V型成骨不全患者中均發(fā)現(xiàn)存在IFITM5基因的5'UTR的c.-14C＞T突變，該類(lèi)患者臨床特征主要是前臂骨間膜鈣化和增生性骨痂形成。
　　microRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度21

2、-23個(gè)核苷酸，廣泛存在于多物種的內(nèi)源性、非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。已證實(shí)miRNA廣泛參與了多種生理病理過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡。研究表明miRNA可靶向調(diào)控成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵基因以調(diào)控成骨細(xì)胞的分化。但是，到目前為止，還沒(méi)有生物學(xué)證據(jù)發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控成骨細(xì)胞礦化相關(guān)基因IFITM5的miRNA，從而調(diào)控成骨細(xì)胞的礦化。
　　目的:本研究旨在發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控IFITM5基因的microRNA，并驗(yàn)證micr

3、oRNA對(duì)成骨細(xì)胞礦化、分化的影響。
　　方法:應(yīng)用TargetScan、miRanda、Microcosm和DIANA-microT等4個(gè)靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件中至少兩個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果的交集來(lái)判定microRNA和IFITM5是否存在靶標(biāo)關(guān)系。人工合成microRNA mimics，并構(gòu)建野生型、突變型pmirGLO-IFITM5-3'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體，通過(guò)FuGENE HD轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性以篩選出結(jié)合于

4、IFITM5-3'UTR的microRNA，進(jìn)一步通過(guò)Western blotting檢測(cè)篩選出顯著下調(diào)IFITM5蛋白的microRNA。最終篩選出的microRNA轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞后，誘導(dǎo)礦化后采用茜素紅染色法觀(guān)察礦化結(jié)節(jié)的形成，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分化標(biāo)志蛋白ALP、OCN、Runx2等基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出28個(gè)相關(guān)microRNA，其中15個(gè)為三個(gè)及以上數(shù)據(jù)庫(kù)共有。(2)通過(guò)野生型雙熒

5、光素酶報(bào)告載體與microRNA mimics共轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，以實(shí)驗(yàn)組熒光值相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)30％以上為原則，篩選出miR-1296、miR-2861、miR-4316、miR-661、miR-762;構(gòu)建上述五個(gè)突變型雙熒光素酶報(bào)告載分別與各自microRNA mimics共轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，篩選出miR-2861、miR-4316、miR-762。(3)將上述三個(gè)microRNA轉(zhuǎn)染到Saos-2細(xì)胞，Western b

6、lotting結(jié)果顯示miR-762、miR-4316顯著降低IFITM5蛋白表達(dá)水平。(4)茜素紅染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于空白對(duì)照組，在誘導(dǎo)礦化72h后miR-762組均抑制礦化結(jié)節(jié)的形成;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)礦化標(biāo)志蛋白ALP、OCN、Runx2，相比于對(duì)照組，miR-762組ALP、OCN、Runx2的mRNA表達(dá)量均下降。
　　結(jié)論:篩選出負(fù)向調(diào)控IFITM5的miR-762、miR-4316，并驗(yàn)證了miR-762抑制成骨