慢病毒介導RNA干擾α1,干擾α1,3GT、NF-κB控制異種心臟移植排斥反應研究.pdf

1、本研究構建了針對小鼠α1，3半乳糖基轉移酶(α1，3 galactosyltransferase，α1，3GT)和核轉錄因-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)RelA亞基基因的短發(fā)夾狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)慢病毒載體，通過體外轉染小鼠血管瘤內皮細胞(EOMA)的方法，研究RNA干擾α1，3GT和RelA基因表達的效果，并篩選針對每種基因相對高效的shRNA慢病毒；通過經陰莖

2、背靜脈注射慢病毒載體的方法體內轉染小鼠心臟，研究慢病毒載體的體內轉染效率及對靶基因的體內抑制效果；并以獲得的α1，3GT和RelA表達減低的小鼠心臟為供體，建立穩(wěn)定的小鼠-大鼠異種異位心臟移植模型，研究慢病毒介導的RNA干擾α1，3GT和RelA在小鼠-大鼠異種心臟移植模型中控制異種移植排斥反應的作用并探討其機制。
　　 第一部分、α1，3GT和RelA shRNA慢病毒載體的構建及體外實驗研究
　　 目的：構建針對小鼠

3、α1，3GT和RelA基因的shRNA慢病毒載體，探討shmYA慢病毒載體的體外轉染效率及對α1，3GT和RelA基因的抑制效果，并篩選相對高效的shRNA慢病毒載體。
　　 方法：針對α1，3GT和RelA mRNA分別設計合成三條特異性shRNA，并分別構建并合成高滴度的攜帶α1，3GT和RelA shmNA質粒的重組慢病毒載體，設置空白對照組，陰性病毒對照組、三個α1，3GT-shRNA慢病毒干預組和三個RelA-shRN

4、A慢病毒干預組，分別轉染EOMA并優(yōu)化轉染條件；以熒光實時定時PCR和免疫熒光檢測轉染后EOMA中α1，3GT和RelA及Galα1，3Gal抗原的表達情況。
　　 結果：針對α1，3GT和RelA的shRNA質粒構建成功，并得到了高滴度攜帶α1，3GT和RelA shRNA質粒的重組慢病毒載體并可高效穩(wěn)定轉染EOMA；與對照組相比α1，3GT和RelA shRNA慢病毒干預組EOMA的α1，3GT和RelA mRNA轉錄水平均

5、顯著降低(p<0.01)，α1，3GT-shRNA慢病毒干預組EOMA的Galα1，3Gal抗原水平較對照組顯著降低(p<0.01)；其中α1，3GTi-3和RelAi-3 shRNA慢病毒干預組對目的基因的表達抑制最為明顯。
　　 結論：應用成功構建的α1，3GT和RelA shRNA慢病毒載體可高效穩(wěn)定轉染EOMA，并可顯著抑制α1，3GT、RelA基因及Galα1，3Gal抗原的表達，α1，3GTi-3和RelAi-3sh

6、KNA慢病毒為相對高效病毒，可進一步用于體內實驗和動物實驗。
　　 第二部分、經陰莖背靜脈注射慢病毒載體的小鼠體內實驗
　　 目的：評價經陰莖背靜脈注射shRNA慢病毒載體轉染小鼠心臟的轉染效果，探討慢病毒介導的RNA干擾α1，3GT和RelA的體內抑制效果。
　　 方法：設(1)生理鹽水對照組、(2)陰性慢病毒組、(3)α1，3GTi-3-shRNA慢病毒組、(4)RelAi-3-shRNA慢病毒組和(5)雙病

7、毒組，經陰莖背靜脈注射干預小鼠心臟，于注射140h后取小鼠心臟及肝、脾組織，應用熒光顯微鏡觀察組織冰凍切片EGFP綠色熒光的方法評價心臟轉染效果及慢病毒載體在體內各臟器的分布情況；分別以實時定量熒光PCR、免疫熒光染色法和Westernblot檢測轉染后α1，3GT和RelAmRNA、Galα1，3Gal抗原和RelA蛋白表達情況。
　　 結果：慢病毒干預組小鼠心臟綠色熒光強度明顯強于鹽水對照組，尤以心肌血管內皮為強；肝、脾組織

8、亦有少量綠色熒光分布，但遠較心臟組織為弱；shRNA慢病毒干預組目的基因mRNA表達水平比對照組明顯降低(p<0.01)，但單一病毒干預組與雙病毒干預組間比較，目的基因的mRNA表達水平無顯著性差異(p>0.05)；α1，3GTi-3-shRNA慢病毒組心臟血管內皮Galα1，3Gal抗原表達水平比對照組明顯降低；(4)、(5)組RelA蛋白表達水平與對照比較明顯降低(p<0.01)，但(4)、(5)組間比較無顯著性差異(p>0.05)

9、。
　　 結論：于體內經陰莖背靜脈注射的方法可使慢病毒載體在小鼠心臟獲得高效轉染；應用成功構建的shRNA慢病毒載體可在體內有效抑制α1，3GT和RelA基因表達，并可有效降低Galα1，3Gal抗原和RelA蛋白的表達水平，可進一步應用于活體移植實驗。
　　 第三部分、RNA干擾α1，3GT、RelA在異種心臟移植模型中的實驗研究
　　 目的：觀察經陰莖背靜脈注射shRNA慢病毒干預小鼠-大鼠異種異位心臟移植模

10、型中排斥反應的影響，探討其抗排斥反應的機制。
　　 方法：建立小鼠-大鼠異種異位心臟移植模型；以經陰莖背靜脈注射shRNA慢病毒干預Balb/c小鼠心臟，140h后以之為供體，移植至F344大鼠頸部，共設(1)生理鹽水對照組、(2)陰性慢病毒組、(3)α1，3GTi-3-shRNA慢病毒組、(4)RelAi-3-shRNA慢病毒組和(5)雙病毒組，每組各8只；觀察移植心臟存活情況；待供心停跳后，取供心標本，分別以實時定量熒光PC

11、R、免疫熒光染色法和Westernblot檢測供心α1，3GT和RelAmRNA、Galα1，3Gal抗原和RelA蛋白表達情況。
　　 結果：α1，3GTi-3-shRNA慢病毒組和雙病毒組供心存活時間較對照組和RelAi-3-shRNA慢病毒組為長，其差異有顯著(p<0.01)，但此兩組間比較，供心存活時間無顯著性差異(p>0.05)；RelAi-3-shRNA慢病毒組供心存活其與對照組間無顯著性差異(p>0.05)；各sh

12、RNA慢病毒干預組供心排斥后目的基因的mRNA水平與排斥前比較，無顯著性差異(p>0.05)；各shRNA慢病毒干預組相應目的基因的蛋白表達水平在排斥前后亦無顯著性差異(p>0.05)，但對照組供心排斥后RelA蛋白表達水平較排斥前明顯升高(p<0.01)；而shRNA病毒干預組供心排斥后目的基因蛋白表達水平仍均較對照組為低，其差異有顯著性(p<0.01)。
　　 結論：α1，3GTi-3-shRNA慢病毒干預供體，可以有效降低