構(gòu)建小鼠RNA干擾NF-кB-p65慢病毒載體及對小鼠成骨樣細(xì)胞的影響.pdf

1、背景：
　　核轉(zhuǎn)錄因子кB（NF-кB）是一個廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族。P50/p65二聚體是NF-кB家族中最常見的形式。NF-кB激活后可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、免疫受體等的表達(dá)，與人類多種疾病密切相關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)，NF-кB信號通路在機(jī)體骨質(zhì)的形成、吸收及改建等方面起重要的調(diào)節(jié)作用。RANKL、TNF等細(xì)胞因子可激活破骨前體細(xì)胞的NF-кB通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，實現(xiàn)骨吸收。在骨質(zhì)疏松動物模型中，雌激素

2、缺乏可激活NF-кB通路，在促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟的同時，也抑制了成骨細(xì)胞的功能。據(jù)此我們推斷，如能有效抑制NF-кB信號通路，則有望一方面抑制破骨前體細(xì)胞分化成熟，減少骨吸收，另一方面促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，加強(qiáng)其成骨功能，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。為此，本研究針對小鼠NF-кB/p65基因，設(shè)計短發(fā)夾RNA（shRNA）靶序列，構(gòu)建小鼠RNA干擾NF-кB/p65基因慢病毒載體，并感染小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1，進(jìn)一步研究感染后成骨相

3、關(guān)基因表達(dá)的變化。
　　目的：
　　構(gòu)建小鼠NF-кB/p65基因的RNA干擾慢病毒載體，感染小鼠成骨樣細(xì)胞并鑒定。研究NF-кB/p65基因表達(dá)被抑制后成骨細(xì)胞功能的變化。
　　方法：
　　針對小鼠NF-кB/p65基因序列，遵從RNA干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計3個干擾靶點序列，根據(jù)此序列設(shè)計合成寡核苷酸序列，退火后形成分別在5’、3’端含AgeⅠ、EcoRⅠ酶切位點，中間含有19個堿基發(fā)夾環(huán)的小片段DNA雙鏈。用

4、限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ及T4 DNA連接酶，將小鼠NF-кB/p65基因的RNA干擾序列插入慢病毒載體 GV-248。得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α，用含氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選，得到陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。所得質(zhì)粒進(jìn)行測序分析確定載體構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒載體及包裝輔助質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，得到目的病毒并測定相應(yīng)病毒滴度。慢病毒感染MC3T3-E1細(xì)胞后，Real-time PCR及

5、Western blot檢測MC3T3-E1細(xì)胞NF-кB/p65的表達(dá)，得到干擾效果最好的慢病毒載體。將該慢病毒感染MC3T3-E1細(xì)胞，研究對細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并檢測成骨相關(guān)基因ALP、OCN、RANKL的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　本實驗成功構(gòu)建小鼠NF-кB/p65基因的RNA干擾慢病毒載體，感染MC3T3-E1細(xì)胞后，NF-кB/p65基因的表達(dá)明顯受到抑制，同時RANKL基因表達(dá)水平明顯下降， ALP、OCN基因