版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、研究背景和目的:
鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是一種源發(fā)于鼻咽部的頭頸部惡性腫瘤,發(fā)病隱匿,具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能,治療后部分病例容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,盡管放療技術(shù)不斷發(fā)展,鼻咽癌治療療效較十年前有一定的提高,但尚未取得滿意療效。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)理論從新的視角為鼻咽癌發(fā)生和復(fù)發(fā)機制提供了合理的解釋,認(rèn)為鼻咽癌易局部侵襲、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特性與鼻咽癌干
2、細(xì)胞“干性”密切相關(guān),靶向去除鼻咽癌干細(xì)胞,可能是一種“根治”性新策略。核轉(zhuǎn)錄因子κB( nuclear transcription factor kappa B,NF-κB)為鼻咽癌疾病LMP1(EB病毒編碼的潛伏性膜蛋白1)所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)中的信號傳導(dǎo)樞紐,它作為核轉(zhuǎn)錄因子能與靶基因啟動子或增強子區(qū)域的特定序列κB結(jié)合位點結(jié)合誘導(dǎo)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄表達從而發(fā)揮促進腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲,抑制細(xì)胞凋亡及放化療抵抗等生物特性的功能。而信號
3、傳導(dǎo)中這種基因與基因功能區(qū)特異性序列相互結(jié)合及作用很可能為腫瘤發(fā)病中的關(guān)鍵機制及脆弱點。我們預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)鼻咽癌干細(xì)胞中NF-κB持續(xù)激活入核,同時高表達腫瘤干細(xì)胞基因Bmi-1、Twist1,但 NF-κB對鼻咽癌干細(xì)胞生物特性的具體調(diào)控功能及其與干細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系目前尚不清楚,揭示這一病理機制,將為鼻咽癌治療提供新靶點和思路。研究顯示綠茶在防治癌癥疾病中展現(xiàn)良好潛能,其中表沒食子兒茶素沒食子酸脂(Epigallocatechin-
4、3-gallate,EGCG)是綠茶多酚成分防治癌癥的主要成分,其具有低毒、高效的靶向性特點,其抗癌機制與影響NF-κB通路活性密切相關(guān),但EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞的作用及具體機制尚不明確。本論文研究NF-κB/p65對鼻咽癌干細(xì)胞“干性”的功能調(diào)控并探索其調(diào)控機制與轉(zhuǎn)錄表達干細(xì)胞基因Bmi-1、Twist1的關(guān)系;并以此為靶向切入點,研究 EGCG靶向抑制鼻咽癌干細(xì)胞的作用及分子機制,旨在為完善鼻咽癌干細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展機制提供一定理論
5、依據(jù),為挖掘低毒、高效的天然植物小分子靶向腫瘤干細(xì)胞的治療策略奠定實驗及理論基礎(chǔ)。
研究方法:
1.鼻咽癌干細(xì)胞球的分離并鑒定其干性的研究
在優(yōu)化以往實驗條件基礎(chǔ)上采用無血清懸浮成球法從鼻咽癌細(xì)胞系 CNE2及 C666-1中富集能穩(wěn)定傳代的人鼻咽癌微球體;通過 MTT實驗檢測鼻咽癌成球細(xì)胞的增殖能力及化療藥物順鉑的耐受性;軟瓊脂克隆球形成實驗檢測其克隆形成能力;Transwell小室侵襲實驗檢測鼻咽癌成球
6、細(xì)胞的侵襲能力;裸鼠皮下成瘤實驗驗證其體內(nèi)成瘤能力;通過細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞儀分析干細(xì)胞標(biāo)志物CD44的表達情況;Real Time PCR及Western blot于基因蛋白水平檢測EMT標(biāo)志物及干細(xì)胞基因Bmi-1、Twist1的表達情況。
2、NF-κB/p65調(diào)控鼻咽癌干細(xì)胞的作用及機制研究
通過構(gòu)建NF-κB/p65慢病毒沉默鼻咽癌干細(xì)胞中p65的基因表達,再結(jié)合以上一系列的功能實驗(MTT實驗、軟瓊脂克
7、隆球形成實驗、Transwell小室侵襲實驗、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗)檢測沉默NF-κB/p65的表達對鼻咽癌干細(xì)胞增殖、耐藥、侵襲、成瘤等生物特性的影響;再通過Real Time PCR及Western blot實驗檢測沉默p65后EMT標(biāo)志物及干細(xì)胞基因Bmi-1、Twist1的表達差異,最后構(gòu)建Twist1啟動子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)鼻咽癌干細(xì)胞球,用雙熒光素酶檢測沉默p65后Twist1啟動子活性的變化。
3、EGCG抑制 NF-κB/p
8、65活性調(diào)控鼻咽癌干細(xì)胞干性的作用及機制研究
EGCG各濃度干預(yù)鼻咽癌干細(xì)胞球后,通過MTT實驗、克隆球形成實驗、侵襲實驗及動物體內(nèi)成瘤實驗檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞增殖、侵襲、成瘤等生物特性功能的影響;通過流式細(xì)胞儀分析 EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞CD44+細(xì)胞比例的影響;利用細(xì)胞免疫熒光、Real Time PCR及Western blot實驗于細(xì)胞分子水平檢測EGCG對NF-κB/p65活性、EMT標(biāo)志物及干細(xì)胞因子Bmi-
9、1、Twist1蛋白及基因表達的影響;再通過雙熒光素酶分析檢測EGCG對p65所調(diào)控的Twist1啟動子活性的影響。
研究結(jié)果:
1.無血清懸浮培養(yǎng)富集獲得具有干細(xì)胞生物特性的鼻咽癌干細(xì)胞球
采用無血清懸浮培養(yǎng)成球法從人源化鼻咽癌細(xì)胞系 CNE2(低分化鱗癌)、C666-1(未分化型癌)中成功分離獲得鼻咽癌球細(xì)胞CNE2-SC(CNE2 sphere cells)及 C666-1-SC(C666-1 sph
10、ere cells)。將CNE2-SC及C666-1-SC重置于含10%的血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),其能分化為與親本細(xì)胞相同特性的貼壁細(xì)胞;免疫熒光結(jié)果提示:CNE2-SC及C666-1-SC較其親本細(xì)高表達 CD44;FACS檢測分析鼻咽癌球細(xì)胞CD44+細(xì)胞比例,結(jié)果顯示:CNE2-SC較CNE2 CD44+細(xì)胞比例(89.09±2.0%vs4.81±2.01%)及C666-1-SC較C666-1 CD44+細(xì)胞比例(87.21±3.24%
11、vs5.49±1.65%)均明顯偏高,具有顯著差異性(P<0.01)。qRT-PCR和Western blot檢測干細(xì)胞基因及EMT標(biāo)志物的表達,結(jié)果顯示:與親本細(xì)胞比較,CNE2-SC、C666-1-SC細(xì)胞中Twist1、Bmi1及間葉標(biāo)志物N-cadherin Vimentin的mRNA表達均顯著增高(P<0.01),而上皮標(biāo)志物 E-cadherin的 mRNA表達偏低(P<0.05);Western blot實驗結(jié)果提示以上指
12、標(biāo)蛋白表達差異與基因表達情況相符。MTT實驗結(jié)果提示:與親本細(xì)胞比較,CNE2-SC及C666-1-SC細(xì)胞增殖活性及對順鉑耐受性更強。Transwell侵襲實驗結(jié)果提示:CNE2-SC比CNE2的穿膜細(xì)胞數(shù)為268±6個/視野 vs76±7個/視野;而 C666-1-SC比C666-1的穿膜細(xì)胞數(shù)為258±8個/視野vs68±7個/視野,前者均明顯偏高,具有顯著性差異( P<0.01)。軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果示:CNE2-SC、C66
13、6-1-SC分別比較CNE2及C666-1的克隆形成率為28±4%vs8±3%和26±3%vs7±2%,均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。裸鼠成瘤實驗結(jié)果示:1×104個CNE2-SC細(xì)胞于裸鼠體內(nèi)即能起始腫瘤的發(fā)生,在相同細(xì)胞數(shù)量時,CNE2-SC較CNE2成瘤體積更大,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
2. NF-κB/p65在鼻咽癌干細(xì)胞球中激活,沉默其表達能抑制鼻咽癌干細(xì)胞增殖、侵襲、成瘤、耐藥
Wester
14、n blot檢測鼻咽癌干細(xì)胞球與親本細(xì)胞 NF-κB/p65表達差異,結(jié)果顯示:與CNE2及C666-1比較,CNE2-SC及C666-1-SC中NF-κB/p65蛋白表達明顯增強,且p65抑制物Ikba的磷酸化蛋白P-Ikba表達也明顯增強。細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn) NF-κB/p65于 CNE2及C666-1中主要表達定位于胞漿,而于CNE2-SC及C666-1-SC中核轉(zhuǎn)位主要表達定位于細(xì)胞核。構(gòu)建 p65三個序列的干擾慢病毒載體對C
15、NE2-SC、C666-1-SC進行轉(zhuǎn)染、內(nèi)源性篩靶、獲得穩(wěn)定干擾鼻咽癌干細(xì)胞株shp65-CNE2-SC及shp65-C666-1-SC;通過Western blot驗證穩(wěn)定細(xì)胞株p65干擾效率,結(jié)果示:shp65-CNE2-SC及shp65-C666-1-SC與對照干擾組(Scr組)比較,P65蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實驗檢測p65穩(wěn)定干擾細(xì)胞株克隆形成能力,結(jié)果提示:shp65-CNE2-SC、shp65-
16、C666-1-SC分別較對照干擾細(xì)胞Scr-CNE2-SC、Scr-C666-1-SC的克隆球形成率均明顯降低,具有顯著差異性(P<0.01),且克隆球體變?。籘ranswenll小室實驗檢測p65穩(wěn)定干擾細(xì)胞株侵襲力變化,結(jié)果提示:shp65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC分別較Scr-CNE2-SC及Scr-C666-1-SC的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,具有顯著性差異( P<0.01)。MTT實驗檢測不同濃度順鉑對 shp
17、65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC、Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC增殖抑制效應(yīng),結(jié)果示:較對照干擾細(xì)胞株,shp65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC細(xì)胞存活比例明顯降低,具有差異性(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤實驗檢測p65穩(wěn)定干擾細(xì)胞株體內(nèi)成瘤能力,結(jié)果示:shp65-CNE2-SC起始腫瘤的能力下降,接種1×106個細(xì)胞數(shù)量時,對照組成瘤率4/4,而shp65組成瘤率3/4,接
18、種1×105個細(xì)胞數(shù)量時,對照組成瘤率4/4,而shp65組成瘤率2/4,同一細(xì)胞數(shù)量級比較,shp65組形成移植瘤的重量減低,具有統(tǒng)計差異性(P<0.05)。
3.沉默NF-κB/p65表達抑制鼻咽癌干細(xì)胞球EMT及Twist1的轉(zhuǎn)錄表達
Western blot檢測沉默P65表達對鼻咽癌干細(xì)胞EMT標(biāo)志物及干細(xì)胞基因表達的影響,結(jié)果示:與 Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC比較,shp65-CN
19、E2-SC和shp65-C666-1-SC的EMT標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin蛋白表達下降,而E-cadherin表達上升(P<0.05,P<0.01),即 EMT過程受到抑制;與 Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC比較, shp65-CNE2-SC和shp65-C666-1-SC細(xì)胞中 Twist1及Bmi-1的蛋白表達均降低(P<0.05,P<0.01)。構(gòu)建Twist1熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至P65
20、穩(wěn)定干擾細(xì)胞株及對照干擾細(xì)胞株中,熒光素酶檢測Twist1啟動子活性結(jié)果示:與對照組比較, shp65-CNE2-SC及 shp65-C666-1-SC中Twist1啟動子活性均降低,具有統(tǒng)計差異性(P<0.05)。
4.EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞增殖、侵襲、成瘤能力
MTT實驗檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞球細(xì)胞增殖活性的影響,結(jié)果示:與對照組(EGCG0μM)比較,EGCG各劑量干預(yù)組細(xì)胞存活比例呈劑量依賴性降低(P<
21、0.05,P<0.01)。細(xì)胞成球?qū)嶒灆z測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞二次成球能力的影響,結(jié)果示:與對照組比較,EGCG各干預(yù)組細(xì)胞二次成球率呈劑量依賴性降低(P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實驗驗證克隆形成能力,結(jié)果示:與對照組比較,EGCG各干預(yù)組細(xì)胞克隆形成能力呈劑量依賴性抑制(P<0.05,P<0.01);transwenll小室侵襲實驗檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞的侵襲能力的影響,結(jié)果示:與對照組比較,EGCG各干預(yù)組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)呈劑
22、量依賴性逐漸降低(P<0.05,P<0.01)。采用經(jīng)各藥物組(DMSO組,EGCG20μM組,順鉑10μM組, EGCG20μM+順鉑10μM組)干預(yù)處理48小時后的CNE2-SC(1×106個數(shù)量級)行裸鼠皮下成瘤實驗,分析各組成瘤時間,結(jié)果顯示:EGCG組成瘤時間與對照組(DMSO組)比較,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),前者成瘤時間延遲;EGCG聯(lián)合順鉑組與對照組比較,具有顯著差異性(P<0.01),與EGCG或順鉑單獨干預(yù)組比
23、較也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),前者成瘤時間延遲。分析各組成瘤重量結(jié)果顯示:與對照組比較,EGCG組成瘤重量偏低(P<0.05);而與順鉑組比較, EGCG組成瘤重量無明顯差異;但EGCG聯(lián)合順鉑組與對照組比較差異顯著(P<0.01),與各單獨干預(yù)組比較也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。分析比較各組不同時間成瘤體積差異,結(jié)果顯示:EGCG聯(lián)合順鉑組較對照組具有顯著性差異(P<0.01),與各單獨干預(yù)組比較也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);
24、EGCG組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),但與順鉑組比較差異不明顯。
5.EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞的EMT及Bmi-1、Twist1的表達
運用流式細(xì)胞儀檢測EGCG對CNE2-SC及C666-1-SC CD44+細(xì)胞比例的影響,結(jié)果顯示:與對照組(EGCG0uM)比較,EGCG(50μM)干預(yù)組中CNE2-SC細(xì)胞CD44+細(xì)胞比例由(90.14±3.76)%降低至(9.54±2.81)%;C666-1-
25、SC細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例由(85.04±3.30)%降低至(8.93±2.87)%,兩組干預(yù)前后比較具有顯著性差異(P<0.01)。從蛋白及基因水平驗證 EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞 EMT及腫瘤干細(xì)胞基因的影響,RT-PCR檢測結(jié)果提示:N-cadherin、 Vimentin、CD44、Bmi-1、Twist1表達下降,而N-cadherin表達升高(P<0.05,P<0.01);Western blot檢測結(jié)果提示:上述指標(biāo)蛋白表達
26、趨勢與基因表達相符(P<0.05, P<0.01)。
6.EGCG抑制NF-κB/p65活性及影響p65對Twist1的轉(zhuǎn)錄表達
細(xì)胞免疫熒光及Western blot實驗檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞中NF-κB/p65活性的影響,免疫熒光檢測結(jié)果示:與對照組(EGCG0μM)比較,EGCG(25μM,50μM)各干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC中NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位受抑制,核內(nèi)蛋白表達降低,且呈劑量依賴性
27、抑制效應(yīng)。Western blot檢測各EGCG干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC細(xì)胞總蛋白、胞漿蛋白及胞核蛋白p65和P-p65(p65磷酸化蛋白)的表達情況,結(jié)果顯示:各組細(xì)胞總蛋白中 p65表達未有明顯差異;但與對照組比較, EGCG各干預(yù)組細(xì)胞核中p65蛋白表達降低,而于細(xì)胞質(zhì)中p65蛋白表達有所升高,且上述變化趨勢呈劑量依賴性(P<0.05,P<0.01);與對照組比較,EGCG各干預(yù)組細(xì)胞總蛋白中P-p65蛋白表達呈劑
28、量依賴性減弱(P<0.05,P<0.01)。探索EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞是否與影響P65對Twist1的轉(zhuǎn)錄表達有關(guān),通過雙熒光素酶實驗檢測分析各干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC細(xì)胞中Twist1啟動子活性變化,結(jié)果顯示:與對照組(Scr組)比較,EGCG(50μM)干預(yù)組及Shp65組的Twist1啟動子活性均減弱( P<0.05);而 shp65聯(lián)合 EGCG(50μM)干預(yù)組與EGCG(50μM)組或 Shp65組比較,
29、Twist1啟動子活性減弱更明顯(P<0.01)。
結(jié)論:
1.無血清懸浮培養(yǎng)能富集具有干細(xì)胞生物特性的鼻咽癌干細(xì)胞球,其可作為理想的腫瘤干細(xì)胞研究模型。
2.NF-κB/p65在鼻咽癌干細(xì)胞中激活、調(diào)控 EMT及轉(zhuǎn)錄表達Twist1以維持鼻咽癌干細(xì)胞增殖、侵襲、耐藥、成瘤的生物特性。
3. EGCG通過抑制NF-κB/p65活性及EMT過程而抑制鼻咽癌干細(xì)胞干性。
4.NF-κB/p6
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- NF-κB p65和MMP-2在鼻咽癌中的表達及其與預(yù)后關(guān)系的研究.pdf
- NF-κB-p65基因在TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用及可能機制.pdf
- NF-κB-p65,p-IκBα和IκKα在皮膚鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌中的表達及其意義.pdf
- NF-κB-p65、IKKβ在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義.pdf
- EGCG抑制鼻咽癌血管生成的分子機制研究.pdf
- 鹽霉毒抑制鼻咽癌干細(xì)胞的作用及機理研究.pdf
- RNAi抑制NF-ΚB-p65基因的表達及對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞生物活性的影響.pdf
- 人口腔白斑及鱗狀細(xì)胞癌中NF-κB-p65、cyclin D1及CD105表達的研究.pdf
- MIF、NF-ΚB-P65在子宮內(nèi)膜增生癥及Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中的表達及關(guān)系研究.pdf
- Id1和NF-κB亞單位p65在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機制中的協(xié)同作用研究.pdf
- NF-κB沉默對鼻咽癌5-8F細(xì)胞生物學(xué)作用研究.pdf
- 靶向NF-κB-p65的RNA干擾對人胃癌細(xì)胞增殖凋亡的實驗研究.pdf
- miR-9對鼻咽癌增殖、腫瘤干細(xì)胞“干性”、EMT和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用及機制.pdf
- 脊髓NF-κB-p65介導(dǎo)的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及機制研究.pdf
- 鼻咽癌干細(xì)胞的初步研究.pdf
- 放射線對涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞NF-κB-P65蛋白表達與細(xì)胞凋亡的影響.pdf
- EGCG經(jīng)Notch1-Jagged1途徑抑制鼻咽癌干細(xì)胞SP18的增殖.pdf
- E2F-1、NF-κB-P65、P-gp在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達及臨床意義.pdf
- 干性基因Nanog在膀胱癌干細(xì)胞干性維持中的作用研究.pdf
- 構(gòu)建小鼠RNA干擾NF-кB-p65慢病毒載體及對小鼠成骨樣細(xì)胞的影響.pdf
評論
0/150
提交評論