脊髓NF-κB-p65介導(dǎo)的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)，是一種由自身免疫障礙引致免疫系統(tǒng)攻擊關(guān)節(jié)的長期慢性炎癥。這種炎癥會造成關(guān)節(jié)變形直至殘廢，并會因關(guān)節(jié)疼痛及磨損而失去部分的活動能力，會極大影響患者的生活質(zhì)量。盡管目前存在很多抗風(fēng)濕類藥物，如非甾類抗炎藥（Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）、慢作用抗風(fēng)濕藥、腎上腺糖皮質(zhì)激素等，其中新近開發(fā)研究的也為數(shù)不

2、少，包括腫瘤壞死因子-a(Tumor necrosis factor,TNF-a)阻斷劑、抗CD20單抗、炎性因子的中和抗體[白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-1(interleukin-1，IL-1)]。但是探索類風(fēng)濕致病機(jī)理，并且依此研發(fā)相關(guān)新藥仍是醫(yī)學(xué)界的熱點。
　　眾所周知，外周組織損傷或炎癥會引起脊髓一系列的變化，在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中，受損的關(guān)節(jié)組織以及滑膜炎可激活外周傷害性感受器，導(dǎo)

3、致連續(xù)和強(qiáng)烈的傷害性信號向上傳入脊髓進(jìn)行調(diào)制、整合，這樣可能會誘發(fā)脊髓的神經(jīng)免疫反應(yīng)，從而引起細(xì)胞因子、興奮性氨基酸、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase，COX-2)和前列腺素的產(chǎn)生和分泌，進(jìn)而導(dǎo)致脊髓傷害性神經(jīng)元的持續(xù)興奮性增強(qiáng)（即中樞敏化）。有意思的是，脊髓也可以通過信號傳遞調(diào)節(jié)外周炎癥。有確切證據(jù)表明，鞘內(nèi)給予的相關(guān)的一些化合物可減輕外周炎癥，這些化合物包括腺苷、色胺、氯胺酮和嗎啡、沙利度胺、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑

4、、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)p38拮抗劑等。而這些化合物具有一個共同的效應(yīng):減少脊髓神經(jīng)元的興奮性。另外，一些涉及調(diào)節(jié)外周炎癥的通路已經(jīng)被闡明，其中包括由交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)分支組成的自主系統(tǒng)，其支配免疫器官，并可以影響外周的免疫反應(yīng)。另一種機(jī)制即背根反射(dorsal root reflexes，DRR)，可沿軀體傳入神經(jīng)纖維逆向傳遞信號，促使感覺神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)

5、肽，如血管活性腸肽、P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽，從而影響周圍炎癥。此外，下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal，HPA)軸也可以對炎癥形成反饋機(jī)制，其往往涉及自身免疫和炎性相關(guān)疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
　　核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）許多生理活動或病

6、理過程，如炎癥、神經(jīng)元可塑性、突觸傳遞、學(xué)習(xí)、記憶和疼痛。NF-κB通過調(diào)控眾多基因來實現(xiàn)這些過程，其中包括細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），促炎癥酶COX-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），趨化因子和粘附因子。NF-κB的5個亞基已經(jīng)確定，包括gp105/p50（NF-κB1）、p100/p52(NF-κB2)、p65（RelA）、RelB和c-REL，NF

7、-κB的活性形式是這些亞基組成的二聚體。NF-κB最常見和最具特點的二聚體是p50/p65，其廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。先前的研究表明，外圍組織損傷或炎癥可活化脊髓NF-κB/p65，我們的早期工作也發(fā)現(xiàn)NF-κB/p65與TNF-α共表達(dá)于慢性壓迫性損傷模型大鼠的脊髓背角，下調(diào)脊髓NF-κB/p65的表達(dá)可顯著降低坐骨神經(jīng)結(jié)扎引起的機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏。這些研究結(jié)果表明NF-κB/p65參與了中樞敏

8、化。然而，尚不確定脊髓NF-κB/p65是否也參與了外周炎癥的發(fā)生發(fā)展。
　　本研究首先構(gòu)建NF-κB/p65基因RNA干擾（RNA interference，RNAi）慢病毒載體并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察其沉默效應(yīng)以及對IL-1β、TNF-α和COX-2表達(dá)的影響。在體建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）模型，鞘內(nèi)注射慢病毒重組體，探討脊髓NF-κB/p65

9、在AIA大鼠外周炎癥和痛覺過敏中作用。另外，我們還評估了NF-κB/p65對脊髓IL-1β、TNF-α和COX-2表達(dá)的調(diào)控作用，以闡明脊髓NF-κB/p65參與外周炎癥和痛覺過敏的相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分:慢病毒介導(dǎo)RNA干擾對體外培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB/p65基因的沉默效應(yīng)
　　目的:
　　構(gòu)建NF-κB/p65基因RNA干擾慢病毒載體并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察其沉默效應(yīng)

10、以及對IL-1β、TNF-α和COX-2表達(dá)的影響
　　方法:
　　1.針對大鼠NF-κB/p65基因特異性序列，設(shè)計3條NF-κB/p65-siRNA序列及1條陰性對照序列，合成包含各正反義靶序列的互補(bǔ)DNA鏈，退火形成雙鏈DNA，插入到經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的pFU-GW慢病毒載體中，PCR篩選陽性克隆，DNA測序鑒定。與慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0通過lipofectamine 20

11、00共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞293T，滴度測定后-80°冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　2.體外培養(yǎng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定。
　　3.慢病毒重組體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染效率。然后用含1μg/ml脂多糖(Lipopolyssacride，LPS)的培養(yǎng)液刺激細(xì)胞24h。根據(jù)干預(yù)條件不同，實驗分為6組:陰性對照組、LPS組、LPS+LV-NC組、LPS+LV-shNF-κB/p65-1組、

12、LPS+LV-shNF-κB/p65-2組和LPS+LV-shNF-κB/p65-3組。
　　4.倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)改變，Real-Time PCR和Western blotting技術(shù)分別檢測慢病毒重組體對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB/p65mRNA和蛋白的干擾效率，ELISA法檢測培養(yǎng)基中星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎性因子(IL-1β、TNF-α)的變化，Western blot技術(shù)檢測神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞C

13、OX-2的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.測序結(jié)果證實合成的寡核苷酸鏈插入正確，重組載體構(gòu)建成功，測定慢病毒滴度為108～9TU/mL。
　　2.培養(yǎng)神經(jīng)元7d后使用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）特異性抗體對其進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示85％以上為神經(jīng)元。培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞12d后進(jìn)行傳代，傳代2次后使用神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic prot

14、ein，GFAP)特異性抗體對其進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示達(dá)90％以上為星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3.慢病毒重組體能成功轉(zhuǎn)染大鼠脊髓神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元轉(zhuǎn)染效率大于90％，與LV-NC組比較，LPS+LV-shNF-κB/p65-1組和LPS+LV-shNF-κB/p65-2組NF-κB/p65mRNA和蛋白的表達(dá)都明顯下調(diào)，mRNA水平干擾效率達(dá)95％(P＜0.01)，蛋白水平干擾效率達(dá)85％以上(P＜0.01)，而LPS+LV-

15、shNF-κB/p65-3組無明顯下調(diào)(P＞0.05)。相比陰性對照組，神經(jīng)元的LPS組COX-2表達(dá)無明顯變化，LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2能下調(diào)COX-2的表達(dá)，而LV-shNF-κB/p65-3則無明顯作用。另外，星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率大于85％，與LV-NC組比較，LPS+LV-shNF-κB/p65-1組和LPS+LV-shNF-κB/p65-2組NF-κB/p65mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下

16、調(diào)，mRNA水平干擾效率達(dá)92％(P＜0.01)，蛋白水平干擾效率達(dá)83％以上(P＜0.01)，而LPS+LV-shNF-κB/p65-3組無明顯變化(P＞0.05)。相比陰性對照組，星形膠質(zhì)細(xì)胞LPS組的TNF-α、IL-1β和COX-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(TNF-α，P＜0.01;IL-1β，P＜0.01;COX-2，P＜0.05)，LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2能抑制這種上調(diào)效應(yīng)(P＜0.01)，

17、而LV-shNF-κB/p65-3組無這種作用。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了大鼠NF-κB/p65基因的RNA干擾慢病毒載體，其可使大鼠脊髓神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的NF-κB/p65基因表達(dá)下調(diào)，并能抑制LPS導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β和COX-2的上調(diào)效應(yīng)。這樣為我們下一步動物體內(nèi)實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為神經(jīng)系統(tǒng)NF-κB/p65基因功能研究提供一種有效的工具。
　　第二部分:脊髓NF-κB/p65對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)

18、炎外周炎癥以及痛覺過敏的調(diào)控作用
　　目的:
　　炎癥組織的傷害性刺激可能增加脊髓背角神經(jīng)元的興奮性（即中樞敏化），興奮的神經(jīng)元可返回信號并調(diào)控外周炎癥，但是其中的機(jī)制尚不明確。最近的一些研究表明，脊髓NF-κB/p65參與了中樞敏化以及相關(guān)疼痛。我們的目的是研究脊髓NF-κB/p65是否也參與了大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的外周炎癥反應(yīng)及相關(guān)痛覺過敏。
　　方法:
　　1.構(gòu)建大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，在完全性弗氏佐劑(com

19、pleteFreund'sadjuvant，CFA)注射后第3d或10d，鞘內(nèi)給予10ul慢病毒重組體(LV-NF-κB/p65或LV-NC)。根據(jù)干預(yù)條件不同，實驗分為8組:對照組、CFA組、CFA+LV-NC(3d)組、CFA+LV-shNF-κB/p65-1(3d)組、CFA+LV-shNF-κB/p65-2(3d)組、CFA+LV-NC(10d)組、CFA+LV-shNF-κB/p65-1(10d)組、CFA+LV-shNF-κ

20、B/p65-2(10d)組。
　　2.CFA注射后第14d，使用Westernblot技術(shù)、免疫熒光技術(shù)以及EMSA技術(shù)評估脊髓NF-κB/p65蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性。在CFA注射前1d和注射后第6d、第8d、第10d、第12d、第14d、第16d、第18d以及第20d，對大鼠的疼痛相關(guān)行為、足跖腫脹程度進(jìn)行了評估，在第20d，觀察評估大鼠的關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變。此外，在CFA注射后第14d，檢測脊髓炎性介質(zhì)TNF-α，IL-1β和

21、COX-2的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.外周炎癥上調(diào)了脊髓NF-κB/p65蛋白的表達(dá)，其主要分布于脊髓背角的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，CFA注射后第3d或10d，鞘內(nèi)注射LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2都能下調(diào)NF-κB/p65蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性。
　　2.相比陰性對照組，CFA組大鼠的機(jī)械痛閾、熱痛閾明顯下降(P＜0.01)，而足跖腫脹明顯增加(P＜0.01)，CFA注射后第3d或1

22、0d，鞘內(nèi)給予LV-shNF-κB/p65-1和LV-shNF-κB/p65-2都能顯著抑制這些效應(yīng)(P＜0.01)。另外，相比CFA+LV-NC(3d)組，大鼠關(guān)節(jié)炎癥和組織破壞程度在CFA+LV-shNF-κB/p65-2(3d)組顯著降低（P＜0.01），而LV-shNF-κB/p65-1(10d)組輕微降低，但未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);此外，相比CFA+LV-NC(10d)組，CFA+LV-shNF-κB/p65-1(10

23、d)組和LV-shNF-κB/p65-2(10d)組的關(guān)節(jié)炎癥和組織破壞程度無明顯變化(P＞0.05)。CFA注射后第3d，鞘內(nèi)給予LV-shNF-κB/p65-1能下調(diào)脊髓TNF-α和IL-1β的表達(dá)（P＜0.01），但對COX-2的表達(dá)無明顯作用(P＞0.05)，而LV-shNF-κB/p65-2能抑制脊髓TNF-α，IL-1β和COX-2表達(dá)(TNF-α，P＜0.01;IL-1β，P＜0.01;COX-2，P＜0.05)。CFA注

24、射后第10d，鞘內(nèi)注射LV-shNF-κB/p65-1能下調(diào)脊髓TNF-α的表達(dá)（P＜0.05），對IL-1β無顯著作用(P＞0.05)，而LV-shNF-κB/p65-2能同時抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)(P＜0.05)，但兩者都對COX-2無明顯作用(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　外周炎癥上調(diào)了脊髓NF-κB/p65蛋白的表達(dá)，其主要分布于脊髓背角的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。鞘內(nèi)注射LV-shNF-κB/p65能下調(diào)