慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾逆轉(zhuǎn)單因素耐藥細(xì)胞系K562-MDR1耐藥性的研究.pdf

1、研究背景: 耐藥是化療失敗的一個(gè)主要原因。耐藥產(chǎn)生的原因是多因素的，其中MDR1基因編碼的P-gp蛋白最具代表性。在逆轉(zhuǎn)MDR1基因的體外研究中通常采用的是藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥細(xì)胞系，其耐藥為多種因素所致，且耐藥性的維持不夠穩(wěn)定。 逆轉(zhuǎn)MDR1基因及其產(chǎn)物所致耐藥的途徑有多種，但從理論上講，在基因水平逆轉(zhuǎn)MDR1基因才是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。而近來(lái)發(fā)展起來(lái)的RNA干擾技術(shù)，為MDR1基因的逆轉(zhuǎn)提供了一種新的高效特異的方法。

2、 慢病毒載體是一種很有前途的基因轉(zhuǎn)移載體，可感染非分裂細(xì)胞，目的基因整合至靶細(xì)胞基因組而長(zhǎng)期表達(dá)。通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾，使長(zhǎng)效抑制目的基因表達(dá)成為可能。 研究目的: 1．構(gòu)建MDR1基因單因素所致耐藥細(xì)胞模型K562/MDR1。 2．構(gòu)建編碼靶向MDRl基因shRNA的慢病毒載體。 3．研究慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)MDR1基因所致耐藥性的逆轉(zhuǎn)情況。 研究方法: 1．構(gòu)建MDR1

3、基因單因素耐藥細(xì)胞系K562/MDR1：包裝具M(jìn)DR1基因全長(zhǎng)cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染對(duì)化療藥物敏感的白血病細(xì)胞系K562，用秋水仙堿篩選耐藥細(xì)胞，經(jīng)無(wú)限稀釋法克隆，得到單克隆的單因素耐藥細(xì)胞系K562/MDR1。熒光定量PCR檢測(cè)K562/MDR1的MDR1基因，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其P-gp蛋白表達(dá)，柔紅霉素泵出實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P-gp蛋白功能，MTT試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)化療藥物的敏感性。 2．慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾逆轉(zhuǎn)MDR1基因所致耐藥性：

4、構(gòu)建編碼靶向MDR1基因shRNA的慢病毒載體并測(cè)序，包裝慢病毒，感染耐藥細(xì)胞系K562/MDRl和K562/A02，從以下四方面研究RNA干擾后其耐藥性的變化：熒光定量PCR檢測(cè)MDRl基因在mRNA水平的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp蛋白表達(dá)水平的變化，柔紅霉素泵出實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞藥物外排能力的變化，MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞耐藥性的變化。 研究結(jié)果: 1．成功構(gòu)建MDR1基因單因素耐藥細(xì)胞系K562/MDR1：熒光定量PCR示M

5、DR1基因相對(duì)定量值為2.79x10<'3>，遠(yuǎn)高于K562細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面P-gp蛋白表達(dá)高達(dá)96.10％；柔紅霉素泵出率為90.93％，顯示了強(qiáng)大的藥物外排能力；MTT結(jié)果示細(xì)胞明顯對(duì)化療藥物耐藥。 2．成功構(gòu)建編碼靶向MDR1基因shRNA的慢病毒載體：合成編碼shRNA的DNA序列亞克隆到慢病毒載體plentilox 3.7，測(cè)序結(jié)果示插入正確。 3．慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾能有效逆轉(zhuǎn)MDR1基因所致耐

6、藥性：慢病毒顯示出對(duì)耐藥細(xì)胞高效、穩(wěn)定的感染能力，有利于后續(xù)的RNA干擾實(shí)驗(yàn)。熒光定量PCR結(jié)果示RNA干擾后兩種耐藥細(xì)胞的MDRl基因水平均明顯下調(diào)(K562/MDR1下調(diào)達(dá)100％，K562/A02下調(diào)達(dá)96.15％)； 流式細(xì)胞儀檢測(cè)到細(xì)胞表面P-gp蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)(兩種細(xì)胞均達(dá)100％)；柔紅霉素泵出試驗(yàn)證實(shí)干擾后耐藥細(xì)胞藥物外排能力的明顯下降；MTT試驗(yàn)示RNA干擾后耐藥細(xì)胞耐藥性明顯下降。各項(xiàng)指標(biāo)均證實(shí)慢病毒介導(dǎo)

7、的RNA干擾有效逆轉(zhuǎn)了MDR1基因所致耐藥性。 結(jié)論: 1．采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法成功構(gòu)建了MDR1基因單因素所致耐藥細(xì)胞系K562/MDR1，為研究MDR1基因介導(dǎo)的耐藥提供了更穩(wěn)定，更特異的細(xì)胞模型。 2．我們構(gòu)建的編碼靶向MDR1基因shRNA的慢病毒載體，可有效下調(diào)MDR1基因和P-gp蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)MDR1基因介導(dǎo)的耐藥，但基因下調(diào)與蛋白下調(diào)存在時(shí)間上的不同步。 3．慢病毒介導(dǎo)RNA