CD80-CD86基因RNA干擾慢性病毒載體的構(gòu)建及其在抗異基因小鼠心臟移植排斥的作用.pdf

1、器官移植現(xiàn)已成為心、肝、腎等多種臟器終末期疾病的有效治療手段。隨著外科技術(shù)的日臻完善、器官保存和組織培養(yǎng)方法的進步以及免疫抑制劑的有效應(yīng)用,超急性排斥的預(yù)防和急性排斥的防治已取得重大進展,慢性排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植器官慢性失功逐漸成為制約器官移植成功的“瓶頸”,因此,誘導(dǎo)針對供者特異性的免疫耐受是當(dāng)代移植領(lǐng)域亟待解決的重要課題。
　　受者T細(xì)胞對供者抗原的免疫識別、活化和增殖是執(zhí)行器官移植細(xì)胞免疫的基礎(chǔ),在同種異體移植排斥反應(yīng)中起著核心

2、作用。受者T細(xì)胞對同種異體移植抗原的識別包括直接識別和間接識別,目前越來越多的學(xué)者認(rèn)為T細(xì)胞間接識別途徑在移植物慢性失功的發(fā)生機制中占據(jù)關(guān)鍵地位。因此,阻斷間接識別信號通路并闡明其分子生物學(xué)發(fā)生機制在移植免疫耐受中更值得關(guān)注。
　　在間接識別途徑中受者T細(xì)胞的活化同樣需要抗原呈遞細(xì)胞表面共刺激分子與受者T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體的結(jié)合,這其中CD80/CD86-CD28是最重要的一條共刺激通路。為此,本課題采用目前國際上較先進的RNA干

3、擾技術(shù)--慢病毒介導(dǎo)RNA干擾,抑制受者樹突狀細(xì)胞表面CD80和CD86的表達,通過體內(nèi)、體外實驗觀察阻斷間接識別通路對小鼠心臟移植的影響,并探討其相關(guān)機制。
　　第一部分小鼠CD80/CD86基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　目的：構(gòu)建小鼠CD80和CD86基因RNA干擾慢病毒表達載體,并在體外觀察其對小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞的作用。
　　方法：針對已經(jīng)篩選確定的CD80基因RNA干擾有效靶序列,合成靶序列的雙

4、鏈DNA,接入pGCL-GFP載體,再與pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒,以293T細(xì)胞GFP蛋白的表達水平測定病毒滴度;同法構(gòu)建出CD86基因RNA干擾慢病毒載體。慢病毒感染體外培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞,通過熒光顯微鏡檢測感染效率,Annexin V/PI雙染色法檢測感染細(xì)胞凋亡和壞死情況,流式細(xì)胞儀檢測CD80和CD86的表達情況。
　　結(jié)果：PCR和測序證實,IN-GFP-shCD80

5、和LV-RFP-shCD86慢病毒載體構(gòu)建正確,病毒滴度均達2×107TU/ml,適合感染樹突狀細(xì)胞的MOI值為20,此時慢病毒對樹突狀細(xì)胞具有低毒性,感染效率為85.42％。CD80和CD86表達的抑制率分別為82.05％和77.78％。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建出小鼠CD80和CD86基因RNA干擾慢病毒載體,其能明顯抑制樹突狀細(xì)胞表面CD80和CD86的表達,這為抗移植物排斥提供了新的治療手段。
　　第二部分重組慢病毒預(yù)處理

6、的負(fù)載供者抗原的受者DC阻斷共刺激通路作用的體外研究
　　目的：觀察重組慢病毒處理受者樹突狀細(xì)胞吞噬供者抗原的能力以及吞噬后樹突狀細(xì)胞生物免疫學(xué)特性的變化。
　　方法：在樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入供者抗原,通過與受者脾臟T細(xì)胞進行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),觀察受者樹突狀細(xì)胞負(fù)載供者抗原的有效性。應(yīng)用實時定量RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測CD80/CD86mRNA和蛋白的表達情況。通過初次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),了解重組慢病毒處理樹突狀細(xì)胞

7、刺激受者T細(xì)胞的增殖能力,并用這種樹突狀細(xì)胞預(yù)致敏小鼠行再次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),觀察受者T細(xì)胞針對間接識別途徑或直接識別途徑提呈的供者抗原的免疫活性。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測初次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IL-10和INF-γ的含量。
　　結(jié)果：在培養(yǎng)過程中加入供者抗原的受者樹突狀細(xì)胞具有顯著刺激受者T細(xì)胞增殖的能力。LV-GFP-shCD80和LV-RFP-shCD86同時感染樹突狀細(xì)胞進一步降低CD80/CD8

8、6 mRNA和蛋白的表達,這種抑制作用不可被脂多糖等刺激所逆轉(zhuǎn)。初次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示,重組慢病毒處理受者樹突狀細(xì)胞能夠有效減弱對受者T細(xì)胞的刺激增殖作用。再次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示,重組慢病毒處理受者樹突狀細(xì)胞能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對供者抗原的免疫低反應(yīng)。培養(yǎng)上清中T111細(xì)胞因子(IL-2和INF-γ)的含量明顯減少,而Th2細(xì)胞因子(IL-10)的含量顯著增高。
　　結(jié)論：受者樹突狀細(xì)胞能夠有效的提呈供者抗原。重組慢病毒明顯抑制

9、樹突狀細(xì)胞表面CD80和CD86的表達。重組慢病毒處理的樹突狀細(xì)胞可抑制其刺激受者T細(xì)胞的增殖反應(yīng),誘導(dǎo)局部細(xì)胞因子譜系向Th2型偏移;重組慢病毒處理的樹突狀細(xì)胞可誘導(dǎo)抗原特異性的T細(xì)胞免疫低反應(yīng)性。
　　第三部分重組慢病毒預(yù)處理負(fù)載供者抗原的受者DC在小鼠心臟移植模型中抗排斥反應(yīng)的研究
　　目的：建立同種異體小鼠異位心臟移植模型,探討重組慢病毒處理的受者樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)誘導(dǎo)移植免疫耐受的可行性及其免疫學(xué)機制。
　　方

10、法：改進Cuff技術(shù)制作小鼠頸部異位心臟移植模型,使用自制套管將供心肺動脈套接于受者右頸外靜脈,將供心升主動脈套接于受者右頸總動脈。移植術(shù)前7天經(jīng)尾靜脈輸注慢病毒處理的受者樹突狀細(xì)胞預(yù)處理小鼠或聯(lián)合腹腔注射小劑量環(huán)孢素A。觀察小鼠移植心臟的存活時間和組織病理學(xué)改變。Annexin V/CD3雙染色法檢測受者淋巴組織和移植心臟中T細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞儀檢測受者脾臟和移植心臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的含量。采用半定量RT-PCR方法檢測小鼠移植心臟

11、中細(xì)胞因子IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-10 mRNA的表達水平以及脾臟T細(xì)胞中凋亡信號通路相關(guān)基因的表達水平。
　　結(jié)果：小鼠頸部異位心臟移植手術(shù)成功率92.5％。手術(shù)時間約60分鐘,供心冷缺血時間小于30分鐘。重組慢病毒處理受者樹突狀細(xì)胞明顯延長小鼠移植心臟的存活時間(平均存活時間為21.8天)。聯(lián)合腹腔注射小劑量環(huán)孢素A,平均存活時間延長至72天,其中有3只小鼠移植心臟存活時間超過100天。小鼠

12、移植心臟組織中Th1細(xì)胞因子(IL-2、INF-γ和TNF-α)的表達明顯低下,而Th2細(xì)胞因子(IL-10)的表達顯著升高。重組慢病毒處理受者樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)受者脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和移植心臟中T細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)移植心臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。小鼠脾臟T細(xì)胞中Bax和GRP78 mRNA的表達有明顯增高;小鼠脾臟T細(xì)胞中CHOP mRNA表達顯著上調(diào)、Bcl-xL mRNA表達顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：改良Cuff技術(shù)成功建立小鼠頸部異位