靶向gyrA基因反義肽肽核酸體外抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長的研究.pdf

1、第一部分、多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因高效反義寡核苷酸序列的篩選
　　目的:篩選出能與多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的mRNA緊密結合的反義寡核苷酸序列。
　　方法:利用Mfold、RNA Structure4.6兩種計算機軟件對多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的mRNA進行二級結構分析計算，根據(jù)最低自由能原則在其mRNA局部雜交松弛區(qū)設計一系列反義寡核苷酸，與體外轉錄的地高辛標記的gyrA mRNA進行斑點雜交，根據(jù)

2、雜交信號的強弱驗證其有效性，篩選與gyrA mRNA緊密結合的反義寡核苷酸序列。
　　結果:寡核苷酸探針與gyrA mRNA斑點雜交結果顯示計算機軟件設計的10條反義寡核苷酸探針中，有5條顯示出雜交信號，其中1條雜交信號最強，能夠與gyrA mRNA穩(wěn)定結合。
　　結論:計算機輔助設計可作為初步篩選靶基因反義序列的方法，斑點雜交可模擬體內環(huán)境對設計的寡核苷酸與靶基因結合的有效性進行體外驗證，兩者聯(lián)合應用操作簡便快捷，經濟有效

3、，可作為一種在體外高通量篩選高效反義序列的方法。
　　第二部分、靶向gyrA基因反義肽肽核酸體外抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長
　　目的:研究以gyrA基因為靶點的反義肽核酸(peptide nucleicacid, PNA)對多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因表達的抑制作用和體外抗菌活性，探討其作為新型抗感染制劑的潛在應用價值。
　　方法:根據(jù)第一部分篩選出的能與多重耐藥鮑曼不動桿菌CY-623生長必需基因gyrA mR

4、NA緊密結合的反義寡核苷酸序列，合成肽核酸(PNA) PNA1，同時在gyrA基因轉錄起始區(qū)設計一條反義寡核苷酸序列，覆蓋SD序列與起始密碼子AUG,合成肽核酸PNA2。兩條PNA分別與穿膜肽(cellpenetrating peptide，CCPs)序列(KFF)3K連接形成peptide-PNA(PPNA)。分別用不同濃度的PPNA1、PPNA2和堿基錯配的PPNA3以及為連接(KFF)3K的PNA1處理CY-623菌株，37℃培養(yǎng)

5、不同時間后測定細菌OD600值并做平板菌落計數(shù)觀察其對細菌生長的抑制作用。采用逆轉錄(RT)-PCR檢測gyrA基因mRNA表達水平觀察其對靶基因表達的作用。
　　結果:PPNA1、PPNA2均具有明顯的靶基因抑制作用和體外抗菌活性，并且具有時間和濃度依賴性，兩者的最低抑菌濃度分別為5μmol/L和10μmol/L，PPNA1與PPNA2聯(lián)合使用時最低抑菌濃度為10μmol/L，其中PPNA1、PPNA2各5μmol/L。而PPN