靶向gyrA基因反義肽肽核酸體外抑制多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌生長的研究.pdf

1、第一部分、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌gyrA基因高效反義寡核苷酸序列的篩選
　　目的:篩選出能與多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌gyrA基因的mRNA緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列。
　　方法:利用Mfold、RNA Structure4.6兩種計(jì)算機(jī)軟件對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌gyrA基因的mRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析計(jì)算，根據(jù)最低自由能原則在其mRNA局部雜交松弛區(qū)設(shè)計(jì)一系列反義寡核苷酸，與體外轉(zhuǎn)錄的地高辛標(biāo)記的gyrA mRNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，根據(jù)

2、雜交信號(hào)的強(qiáng)弱驗(yàn)證其有效性，篩選與gyrA mRNA緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列。
　　結(jié)果:寡核苷酸探針與gyrA mRNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果顯示計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)的10條反義寡核苷酸探針中，有5條顯示出雜交信號(hào)，其中1條雜交信號(hào)最強(qiáng)，能夠與gyrA mRNA穩(wěn)定結(jié)合。
　　結(jié)論:計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)可作為初步篩選靶基因反義序列的方法，斑點(diǎn)雜交可模擬體內(nèi)環(huán)境對(duì)設(shè)計(jì)的寡核苷酸與靶基因結(jié)合的有效性進(jìn)行體外驗(yàn)證，兩者聯(lián)合應(yīng)用操作簡便快捷，經(jīng)濟(jì)有效

3、，可作為一種在體外高通量篩選高效反義序列的方法。
　　第二部分、靶向gyrA基因反義肽肽核酸體外抑制多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌生長
　　目的:研究以gyrA基因?yàn)榘悬c(diǎn)的反義肽核酸(peptide nucleicacid, PNA)對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌gyrA基因表達(dá)的抑制作用和體外抗菌活性，探討其作為新型抗感染制劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:根據(jù)第一部分篩選出的能與多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌CY-623生長必需基因gyrA mR

4、NA緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列，合成肽核酸(PNA) PNA1，同時(shí)在gyrA基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)設(shè)計(jì)一條反義寡核苷酸序列，覆蓋SD序列與起始密碼子AUG,合成肽核酸PNA2。兩條PNA分別與穿膜肽(cellpenetrating peptide，CCPs)序列(KFF)3K連接形成peptide-PNA(PPNA)。分別用不同濃度的PPNA1、PPNA2和堿基錯(cuò)配的PPNA3以及為連接(KFF)3K的PNA1處理CY-623菌株，37℃培養(yǎng)

5、不同時(shí)間后測定細(xì)菌OD600值并做平板菌落計(jì)數(shù)觀察其對(duì)細(xì)菌生長的抑制作用。采用逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測gyrA基因mRNA表達(dá)水平觀察其對(duì)靶基因表達(dá)的作用。
　　結(jié)果:PPNA1、PPNA2均具有明顯的靶基因抑制作用和體外抗菌活性，并且具有時(shí)間和濃度依賴性，兩者的最低抑菌濃度分別為5μmol/L和10μmol/L，PPNA1與PPNA2聯(lián)合使用時(shí)最低抑菌濃度為10μmol/L，其中PPNA1、PPNA2各5μmol/L。而PPN