抗體靶向的長循環(huán)陽離子脂質體介導DNA和siRNA轉染的制劑學研究.pdf

1、近年來，我國女性乳腺癌的發(fā)病率迅速上升。乳腺癌已經(jīng)是危害我國婦女健康的主要惡性腫瘤之一。目前，乳腺癌的常用治療手段主要是手術治療、放射治療和化療。這些手段雖然可使患者獲得較高的生存率甚至治愈，但術后復發(fā)及遠處轉移的問題仍然是困擾學者們的一大難題。隨著分子生物學技術及免疫學技術的迅猛發(fā)展和人類對乳腺癌發(fā)病機制認識的不斷深入，基因治療逐漸成為腫瘤生物學治療中的重要組成部分，在乳腺癌治療中顯示出良好的應用價值，并且取得了一定的效果，日漸成為一

2、項有前景的治療選擇。 目前基因治療的研究和臨床應用中常用的載體分為病毒載體和非病毒載體，各個載體均有各自的優(yōu)缺點，病毒載體主要的潛在缺點包括：①致病可能性；②免疫原性；③大規(guī)模生產(chǎn)的困難性。而非病毒導入系統(tǒng)正受到更多的關注，它的主要的優(yōu)點包括安全，容易大規(guī)模生產(chǎn)等，主要缺點是不能獲得較高水平的基因導入和表達[1-3]。陽離子脂質體(Cationic liposomes，CL)是目前用于基因治療的研究最廣泛的非病毒類載體之一，具有

3、毒性低、轉移的核苷酸大小范圍廣(從寡核苷酸到人工染色體均可)、制備方法較簡單等優(yōu)點。但是該載體仍存在轉染效率較低、靶向性差等問題。設計合理的CL微粒給藥體系，以提高目的基因的高效靶向表達是當前藥劑學研究的熱點之一[3-4]。 在乳腺癌患者中，約有25-30％乳腺癌病人的癌組織表達HER2，而且這些HER2陽性的病例往往發(fā)展快，對多種化療和內(nèi)分泌治療不敏感，預后較差，容易轉移復發(fā)。 HER2是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生長

4、因子受體。目前抗HER2治療的途徑主要有以下幾類：①抗HER2單克隆抗體，通過封閉乳腺癌細胞表面HER2受體，阻斷其與各種生長因子的結合，從而抑制受體激活：②酪氨酸激酶抑制劑；③反義基因技術。但由于抗HER2單克隆抗體本身限制及酪氨酸激酶抑制劑副作用較嚴重，而反義基因方法抑制基因表達的效果又較弱，故他們都不能達到滿意的臨床效果。因此，開發(fā)一種更加有效、安全的抗HER2藥物成為研究的熱點。 本研究制備的制劑，以靶向乳腺癌細胞株HE

5、R2抗原的人源化單克隆抗體Fab’片段作為載質粒DNA或小干擾RNA的PEG化的免疫脂質體的靶向配體，這樣可以特異性的將質粒DNA或小干擾RNA運載到體內(nèi)HER2高表達的乳腺癌組織。本研究同時進行了靶向性的免疫長循環(huán)陽離子脂質體介導siRNA轉染的制劑學研究及體外細胞學研究(Long-circulation Cationic Immunoliposomes，CIL)及非靶向性的長循環(huán)陽離子脂質體(Long-circulating Cat

6、ionic liposomes，LCL，)介導DNA和siRNA轉染的制劑學研究及體外細胞學研究。 對于非靶向的陽離子脂質體(含PEG和不含PEG)，粒徑分析結果為：在未復合物核酸之前，陽離子脂質體的粒徑為150 nm左右。一旦復合核酸，脂質體/核酸復合物的粒徑呈有規(guī)律的變化。隨著DC-chol/核酸比例的升高，脂質體/核酸粒徑呈先升高后降低的趨勢。脂質體/DNA的峰值出現(xiàn)在DC-chol/DNA=2，而脂質體/siRNA的峰值

7、出現(xiàn)在DC-chol/DNA=3或5。非靶向陽離子脂質體的zeta電位一般來講均為正值，隨著DC-chol/DNA或siRaNA比值越來越高，脂質體的zeta電位越來越大，然而超過一定數(shù)值時，zeta電位出現(xiàn)平臺期。 凝膠阻滯實驗結果：當DC-chol/DNA=2，凝膠恰好將DNA阻滯住；而siRNA的包封率曲線結果：當DC-chol/siRNA=3或5時，絕大部分的脂質體的siRNA包封率接近100％。PEG對非靶向陽離子脂質

8、體的DNA結合能力影響輕微。然而，PEG化能大大減弱非靶向陽離子脂質體對SiRNA的結合能力，甚至在DC-chol/siRNA＞15時，脂質體均不能將siRNA完全阻滯住。 陽離子脂質體的核酸穩(wěn)定性分析是通過DNA的DNaseI酶切實驗和siRNA的血清穩(wěn)定性實驗來驗證的。結果表明非靶向陽離子脂質體能顯著增加核酸的穩(wěn)定性。 非靶向陽離子脂質體的轉染實驗以DC-chol和DOPE的比例，DC-chol和核酸的質量比、PEG

9、(聚乙二醇)修飾的程度以及有無血清全面評估了影響陽離子脂質體轉染的因素，得到了最適合進行基因轉染的DOPE/DC-chol脂質體。于質粒DNA來說，最優(yōu)的DC-chol/DOPE比例為1/2，而對于siRNA來說，最優(yōu)的DC-chol/DOPE比例為1。PEG對本研究中的陽離子脂質體影響巨大，隨著PEG含量的增加，轉染效率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。血清對非靶向陽離子脂質體的DNA轉染效率影響不大。有血清轉染和無血清轉染沒有明顯的轉染效率差異；

10、血清對DC-chol/DOPE脂質體的siRNA轉染效率影響較大。對于不同配比的DC-chol/DOPE脂質體來說，無血清轉染效率要高于有血清轉染效率。 對于靶向HER2的免疫陽離子脂質體(Liposomes conjugated with Anti-HER2 Fab'，HER2-Flip)，本研究將Anti-HER2 Fab'作為靶向性抗體片段連接于含4％PEG的陽離子脂質體的表面--抗體靶向的方式，并通過體外實驗證實，HER