陽離子脂質(zhì)體運(yùn)載基因跨膜機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在臨床應(yīng)用和生物學(xué)研究領(lǐng)域都已經(jīng)取得了很大的發(fā)展,但是DNA分子本身不能很好地完成內(nèi)在化過程,因此,這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵在于如何使基因有效地進(jìn)入細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)載體系統(tǒng)可以高效轉(zhuǎn)運(yùn)基因,載體主要包括病毒載體和非病毒載體。由于病毒載體的安全性問題,如誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和感染等限制了它的推廣應(yīng)用,所以盡管非病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率與病毒載體系統(tǒng)相比不夠理想,但近年來發(fā)展速度很快。
　　 陽離子脂質(zhì)體是最主要的非病毒

2、載體之一,它具有可自然降解、免疫原性低、可重復(fù)轉(zhuǎn)染、易于制備等優(yōu)點(diǎn)。然而,由于細(xì)胞內(nèi)外所存在的某些獨(dú)特的生物學(xué)障礙,例如血清中DNA核酸酶的降解和吞噬細(xì)胞對(duì)部分DNA的清除等,如果不了解其作用機(jī)制,就很難獲得思路上的突破,更不能保證體內(nèi)試驗(yàn)的成功和臨床應(yīng)用。
　　 在以往的研究中,人們主要關(guān)注于細(xì)胞對(duì)自身體內(nèi)其他物質(zhì)的攝取,對(duì)于細(xì)胞膜上物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)纳飳W(xué)研究比較多,但是針對(duì)各種藥物例如基因轉(zhuǎn)染中藥物載體的運(yùn)輸機(jī)制的研究相對(duì)較少

3、。本研究旨在將生物學(xué)領(lǐng)域細(xì)胞膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與基因傳遞結(jié)合起來,使用不同的抑制劑,抑制細(xì)胞膜上的各種攝取路徑,即抑制轉(zhuǎn)染過程,然后檢測(cè)目的基因表達(dá)情況,定性以及定量檢測(cè)抑制作用對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率的影響,以探究轉(zhuǎn)染過程所涉及的跨膜機(jī)制,為更好地了解和克服轉(zhuǎn)運(yùn)過程的生物學(xué)障礙提供參考。
　　 方法:
　　 利用細(xì)胞膜上物質(zhì)運(yùn)輸通道的相關(guān)抑制劑,在基本不影響細(xì)胞活性的條件下,分別針對(duì)不同的路徑,抑制細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的攝取。其中

4、將氯丙嗪、渥曼青霉素作為網(wǎng)格蛋白抑制劑,氯丙嗪可以通過抑制網(wǎng)格蛋白包被小窩在膜上的聚集抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的攝取路徑。渥曼青霉素能夠影響內(nèi)體雙層外殼結(jié)構(gòu)的形成來減少細(xì)胞內(nèi)內(nèi)體囊泡,從而抑制攝取過程。高金雀花堿能夠通過調(diào)節(jié)啟動(dòng)小窩蛋白的信號(hào)通路抑制小窩蛋白所介導(dǎo)的攝取路徑,因此將高金雀花堿作為小窩抑制劑。長春花堿能夠影響肌動(dòng)蛋白骨架正確聚合成肌動(dòng)蛋白微絲并促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架解離,因此能夠抑制微管微絲介導(dǎo)的攝取路徑。
　　 加入化學(xué)抑

5、制劑后,利用膜通道抑制劑干擾細(xì)胞對(duì)復(fù)合物的攝取,然后測(cè)定基因轉(zhuǎn)染的效率。將能夠調(diào)控綠色熒光蛋白的基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞當(dāng)中,經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng),在倒置熒光顯微鏡下觀察表達(dá)蛋白發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度的變化。而熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)后,在化學(xué)底物發(fā)光液的作用下,通過微光檢測(cè)儀可以定量檢測(cè)不同抑制劑濃度下轉(zhuǎn)染效率的差異,從而評(píng)估這些路徑在復(fù)合物內(nèi)在化中的作用。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,并確定能夠使細(xì)胞保持較高存活率的抑制劑濃度,從而比較轉(zhuǎn)染過程對(duì)相應(yīng)路徑的依

6、賴性。
　　 結(jié)果:
　　 1.綠色熒光蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示,加入不同濃度的氯丙嗪、渥曼青霉素、高金雀花堿、長春花堿后,隨著抑制劑濃度的增大,綠色熒光信號(hào)明顯減弱。同時(shí)加入氯丙嗪和高金雀花堿,或渥曼青霉素和高金雀花堿,對(duì)比綠色熒光信號(hào),結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)加入兩種藥物熒光強(qiáng)度減弱程度增大,但是與單獨(dú)加入一種藥物相比,不同抑制劑之間差別不大。
　　 2.熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,加入不同濃度抑制劑后,隨著抑制劑濃度的增加,

7、RUL值均具有不同程度的遞減趨勢(shì)。
　　 3.MTT結(jié)果顯示,將抑制劑濃度控制在一定范圍內(nèi)時(shí),能夠保證細(xì)胞存活率保持在較高水平,使基因轉(zhuǎn)染檢測(cè)結(jié)果具有較高的可信度。用熒光素酶RUL值與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率相比發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞存活率均衡的情況下,隨著藥物濃度的增大,RUL值仍然保持下降趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究表明,網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是本文所用陽離子脂質(zhì)體運(yùn)載基因進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑,其中微管微絲介導(dǎo)的