氮酮促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 研究水溶性氮酮對(duì)體外培養(yǎng)的兔眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性及超微結(jié)構(gòu)的影響，探索水溶性氮酮的眼部安全應(yīng)用濃度；觀察陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000是否能介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)移至兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CECS的條件；探討氮酮（AZONE）促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的作用，觀察氮酮對(duì)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的影響，探索提高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的方法。
　　 方法: 體外培養(yǎng)兔眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞，采用MTT法、掃描

2、和透射電子顯微鏡研究不同濃度水溶性氮酮對(duì)細(xì)胞活性和超微結(jié)構(gòu)的影響；采用細(xì)胞培養(yǎng)方法，以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因，通過(guò)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，用不同的細(xì)胞融合度、脂質(zhì)體濃度、脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，熒光顯微鏡觀察目的基因的表達(dá)；配制不同轉(zhuǎn)染試劑，脂質(zhì)體聯(lián)合pEGFP-N1、氮酮聯(lián)合脂質(zhì)體及pEGFP-N1、氮酮聯(lián)合pEGFP-N1、單純pEGFP-N1、單純脂質(zhì)體、單純氮酮，分別處理兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀及熒光顯微

3、鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，計(jì)算并比較轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)果: 濃度0.1g.L-1以下的水溶性氮酮作用24h對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的活性沒(méi)有明顯影響，濃度0.5g.L-1以上的水溶性氮酮作用24h，可以引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性下降(P<0.01）。在濃度0.1 g.L-1以下水溶性氮酮作用10min，掃描電子顯微鏡可以觀察到角膜內(nèi)皮細(xì)胞膜的裂隙形成，而對(duì)細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)無(wú)明顯損害，濃度0.5 g.L-1及以上的水溶性氮酮可導(dǎo)致細(xì)胞器腫脹甚

4、至細(xì)胞死亡；角膜內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂質(zhì)體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白表達(dá)，Lipofectamine TM 在細(xì)胞融合度為80%～90%，脂質(zhì)體/DNA 為3μl/μg，脂質(zhì)體的量為1.8μl，轉(zhuǎn)染時(shí)間為5 h時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CECS 前以0.1g.L-1 氮酮孵育5min，轉(zhuǎn)染效率最高，單純氮酮、單純脂質(zhì)體及對(duì)照組處理的細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光蛋白，氮酮聯(lián)合脂質(zhì)體及pEGFP-N1對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為42.6%；脂質(zhì)體聯(lián)合pEGFP2

5、N1組的轉(zhuǎn)染效率為21.4%；氮酮聯(lián)合pEGFP-N1組的轉(zhuǎn)染效率為7.2%。單純質(zhì)粒組的轉(zhuǎn)染效率為1%，氮酮加脂質(zhì)體加PEGFP-N1組轉(zhuǎn)染效率高于其他轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。
　　 結(jié)論: 水溶性氮酮在濃度0.1g.L-1可以使角膜內(nèi)皮細(xì)胞膜產(chǎn)生裂隙，而不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性的降低；陽(yáng)離子脂質(zhì)體可有效介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)移至角膜內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，GFP可作為報(bào)告基因優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件。氮酮可促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，在有效的