喹乙醇mAb的制備及其dcTRFIA分析方法的建立.pdf

1、本論文以喹乙醇(OLA)為研究對(duì)象，合成了喹乙醇半抗原(OLA-HS)，偶聯(lián)載體蛋白BSA和OVA，制備得到人工抗原(OLA-HS-BSA和OLA-HS-OVA)，免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選獲得1株雜交瘤細(xì)胞2B3，并制備了相應(yīng)的單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)，在此基礎(chǔ)上開(kāi)展以鑭系元素銪為探針的直接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（dcTRFIA），并與常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和傳統(tǒng)

2、的儀器分析方法（HPLC）進(jìn)行對(duì)比。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.OLA-HS-BSA和OLA-HS-OVA的制備與鑒定
　　琥珀酸酐法合成OLA-HS，采用薄層色譜(TLC)、顯微熔點(diǎn)儀以及質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，均證明半抗原合成成功。活化酯法合成OLA-HS-BSA和OLA-HS-OVA，紫外掃描(UV)及凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行鑒定，紫外掃描圖譜顯示新合成物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生偏移，SDS-PAGE電泳條帶顯示OLA-HS

3、-BSA和OLA-HS-OVA的遷移速度較各自的載體蛋白BSA和OVA慢，證明載體蛋白上成功偶聯(lián)上了一定數(shù)量的半抗原，表明OLA-HS-BSA和OLA-HS-OVA合成成功。將OLA-HS-BSA免疫小鼠，間接ELISA測(cè)血清效價(jià)，icELISA測(cè)其靈敏度，結(jié)果顯示1號(hào)小鼠血清效價(jià)最高，對(duì)OLA半數(shù)抑制濃度(IC50)為183.3 ng·mL-1，免疫效果好。
　　2.喹乙醇單克隆抗體(OLA-mAb)的制備及其免疫學(xué)特性鑒定采用

4、雜交瘤技術(shù)篩選得到一株可穩(wěn)定分泌OLA-mAb的細(xì)胞株2B3，體內(nèi)誘生法大量制備腹水，辛酸-硫酸銨法純化腹水，BCA法測(cè)得純化后腹水蛋白濃度為3.65 mg·mL-1?？贵w特性鑒定表明OLA-mAb的類(lèi)型及亞型均為IgG1，輕鏈為κ鏈，對(duì)OLA的IC50為33.96 ng·mL-1。特異性鑒定結(jié)果顯示OLA-mAb除與卡巴氧的交叉反應(yīng)率達(dá)到3.6％外，對(duì)其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率均小于0.18％。以上結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)獲得了高靈敏度、高特異性

5、的OLA-mAb，可用于后續(xù)免疫分析方法的建立。
　　3.dcTRFIA分析方法的建立
　　本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是建立了一種以Eu3+為探針的dcTRFIA方法，采用金屬螯合劑環(huán)化二乙烯三胺五醋酸酐(cyDTPA)將Eu3+與OLA-mAb偶聯(lián)，制備銪標(biāo)抗體（Eu3+-OLA-mAb）。優(yōu)化增強(qiáng)液配方，確定其中的TTA、TOPO濃度分別為0.45 mol·L-1和0.5 mol·L-1，pH為3.0。開(kāi)展dcTRFIA最佳反應(yīng)條件的

6、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，其包被原最佳濃度為1.0μg·mL-1，Eu3+-OLA-mAb最佳稀釋度為1000倍稀釋;最佳包被緩沖液為0.05 mol·L-1，pH為9.6的CBS; Eu3+-OLA-mAb最佳稀釋液為0.01 mol·L-1，pH為7.0的PBS; OLA標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)的最佳有機(jī)溶劑為含5％甲醇的PBS。條件優(yōu)化后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合，得到一條S型曲線(xiàn)，其IC10和IC50值分別為0.83 ng·mL-1和12.64ng·mL-1。

7、對(duì)飼料、池塘水、自來(lái)水及超純水分別添加2.5 ng·mL-1～130 ng·mL-1的OLA標(biāo)準(zhǔn)品，其回收率處于74.40％～138.25％之間，變異系數(shù)小于15％。經(jīng)HPLC驗(yàn)證，dcTRFIA分析靈敏度高，穩(wěn)定性良好，潛在應(yīng)用價(jià)值非常高。
　　4.間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(icELISA)分析方法的建立通過(guò)對(duì)icELISA法進(jìn)行一系列優(yōu)化，得到一條S型曲線(xiàn)，其IC10和IC50值分別為1.03 ng·mL-1和21.83 ng